Enzymatic Synthesis and Microbial Degradation of β-Amino Acids via Transaminases

Enantiomerenreine β-Aminosäuren sind von erheblicher Bedeutung als Bestandteile zahlreicher Antibiotika und andere Medikamente. Da zur chemischen Synthese von β-Aminosäuren chirale Vorstufen, toxische Materialien und metallische Katalysatoren benötigt werden, werden sie industriell mit enzymatisch katalysierter kinetischer Resolution racemischer β-Aminosäureestern hergestellt. Transaminasen besitzen einige Vorteile, die sie für die Synthese von β-Aminosäuren geeignet machen, zum Beispiel besitzen sie ein breitgefächertes Substratspektrum. Diese Enzyme wurden in dieser Arbeit für die asymmetrische Synthese zur Herstellung von enantiomerenreinen β-Aminosäuren untersucht, sowie die Wiederverwendbarkeit dieser Enzyme mittels Immobilisierung erreicht werden konnte.
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Das Gen, einer in der Literatur beschriebenen Aminotransferase aus Variovorax paradoxus wurde synthetisiert, ein His-Tag angefügt und in einen Expressionsvektor kloniert. Die erfolgreiche heterologe Expression in Escherichia coli wurde mittels Nickelchelat-Affinitätschromatography und SDS-PAGE überprüft und die Aktivität des Enzyms mittels Biotransformation mit mehreren β-Aminosäuren nachgewiesen.
Die Immobilisierung erfolgte aus dem Zellrohextrakt an magnetische M-PVA Beads, sodass hier erstmals für Aminotransferase eine kombinierte Reinigungs- und Immobilisierungsmethode realisiert werden konnte. Die immobilisierte Aminotransferase zeigt Langzeitstabilität in einem Zeitraum von 38 Tagen, mit einer Restaktivität von 50 %. Außerdem ist sie mindestens 7 Mal wiederverwendbar mit einer Restaktivität von 90 %, ist stabil bei höheren Temperaturen und bei höheren pH-Werten. Durch die Immobilisierung an magnetischen Beads ist die Abtrennung des Enzyms aus der Reaktion erheblich erleichtert. Die Aktivität wurde durch kinetische Resolution mehrerer enantiomerenreinen aromatischen β-Aminosäuren bestimmt.
Für die asymmetrische Synthese von enantiomerenreinen aromatischen β-Aminosäuren sollte eine Enzymkaskade verwendet werden, die aus einer Lipase und einer Aminotransferase besteht. Dies ist erforderlich, da das benötigte prochirale Edukt, die β-Ketosäure thermodynamisch instabil ist und durch Hydrolyse eines stabilen β-Ketosäureesters hergestellt wird. Die Lipasen aus Candida rugosa, aus Thermomyces lanuginosus und aus Rhizomucor miehei wurden erfolgreich für die Hydrolyse von β-Ketosäureester eingesetzt und zeigten Aktivität für das Substrat Ethyl Benzoylacetat und seine am Phenylring in para-Stellung substituierten Derivate, so dass nun Enzyme für beide Teilreaktionen der Kaskade zur Verfügung stehen.
Transaminaseaktivität wurde in einem Burkholderia phytofirmans BS115 Stamm nachgewiesen. Deshalb sollte das verantwortliche Enzym näher charakterisiert werden und die Aufnahme von β-Aminosäuren in die Zelle untersucht werden, da es bisher kaum Informationen zum β-Aminosäuremetabolismus in Bakterien gibt. Dazu wurde ein Fermentationsprozess etabliert. Zuerst wurden Schüttelkolbenexperimente mit verschiedenen Konzentrationen von rac-β-Phenylalanin und Glukose durchgeführt. Dies brachte erste Erkenntnisse zum Abbau des (R)- und (S)-β-Phenylalanins und zeigte, dass bei der Reaktion Acetophenon entsteht. Das (S)-Enantiomer wurde nach 21 h bereits vollständig aufgebraucht, in dieser Zeit steigt die Konzentration an Acetophenon an. Nachdem das (S)-Enantiomer abgebaut wurde, sinkt die Konzentration des (R)-Enantiomers. Dieses könnte durch oxidative Desaminierung abgebaut worden sein. Da bei der Biotransformation mit Rohextrakt oder mit aufgereinigtem Enzym mit rac-β-Phenylalanine nach Zugabe von PLP und des Aminoakzeptors nur der Abbau des (S)-Enantiomers beobachtet werden konnte, kann man davon ausgehen, dass eine (S)-selektive Aminotransferase für den Abbau verantwortlich ist. Die (S)-selektive Aminotransferase ist auch geeignet um andere aromatische β-Aminosäuren, die am Phenylring in para-Stellung substituiert sind (mit F, Cl, NO2, CH3O, OH, Br) enantioselektiv abzubauen.
Zur Aufreinigung des für die Transaminaseaktivität in Burkholderia phytofirmans BS115 verantwortlichen Enzyms wurden eine Ammoniumsulfatfällung und eine Anionenaustausch-chromatographie durchgeführt. Ein Aufreinigungsfaktor von insgesamt 10 konnte für die Transaminase erzielt werden.

Enantiopure β-amino acids are of great importance as components of antibiotics or other drugs. Chemical synthesis of β-amino acids requires chiral precursors, hazardous materials and metallic catalyst loading. Enzymatic kinetic resolution of racemic β-amino acid esters is used in industrial processes. Transaminases and their wide substrate scope were found to be a suitable biocatalyst for this synthesis. In this work, aminotransferases were examined for asymmetric synthesis and were immobilized for easy downstream processes.
For this purpose, an aminotransferase from Variovorax paradoxus, which is described in literature and able to convert β-amino acids, was synthesized. ... mehrA His-tag was coupled to the aminotransferase’s coding gene and the resulting sequence was ligated into an expression plasmid. The successful heterologous expression in Escherichia coli was examined via nickel chelate-affinity chromatography and SDS-PAGE. The activity of the expressed enzyme was determined by biotransformation with several β-amino acids.
The His-tagged aminotransferase was immobilized out of the crude cell extract using magnetic M-PVA (polyvinyl alcohol) beads. Thereby, a one-step purification and immobilization approach of aminotransferases was performed for the first time. The immobilized aminotransferase exhibits long term stability with a residual activity of 50 % after 38 days, a 90 % residual activity after 7 cycles of recycling and higher temperature as well as pH stability. Due to immobilization using magnetic beads, it is now an easy downstream processing to recover the enzyme. Activity was determined for kinetic resolution of several enantiopure aromatic β-amino acids.
Asymmetric synthesis of enantiopure aromatic β-amino acids was to be conducted by a lipase and aminotransferase enzyme cascade. This is necessary due to the thermodynamic unfavoured prochiral educt, the β-keto acid, which is freshly prepared via hydrolysis of stable β-keto acid ester. The lipase from Candida rugosa, Thermomyces lanuginosus and Rhizomucor miehei were found to successfully hydrolyze the β-keto acid esters with an exhibited activity toward ethyl benzoylacetate and the, at the phenyl ring para-substituted, derivatives. Hence, both enzymes for asymmetric synthesis of β-amino acids through an enzyme cascade are provided.
The Burkholderia phytofirmans strain BS115 exhibits transaminase activity. To characterize the responsible enzyme and to investigate how the strain BS115 metabolize β-amino acids, several experiments were conducted. The establishment of a fermentation process was necessary as the enzyme is not overexpressed. Thereby high amounts of biomass are needed for its purification. As a first attempt shaking flask experiments were conducted with several
concentrations of rac-β-phenylalanine and glucose. These experiments provided preliminary results about the conversion of (R)- and (S)-β-phenylalanine and it was observed that acetophenone was formed. The (S)-enantiomer was completely consumed after 21 h in this time the acetophenone concentration increased. After total conversion of the (S)-enantiomer the (R)-enantiomer was consumed. The (R)-enantiomer may be converted via oxidative deamination. During biotransformation with crude cell extract and the purified enzyme with rac-β-phenylalanine only the (S)-enantiomer was converted. Hence, the conversion of the (S)-enantiomer is catalyzed by a (S)-selective ω-transaminase. The (S)-selective transaminase is also able to convert several aromatic β-amino acids with F, Cl, NO2, CH3O, OH and Br as residues at the phenyl ring.
Purification of the enzyme responsible for transaminase activity in Burkholderia phytofirmans strain BS115 was performed via ammonium sulfate precipitation and anion exchange chromatography. With this process a purification factor of 10 was achieved for the (S)-selective transaminase.