Entwicklung von 2D- und 3D-zellbasierten Testsystemen für die Analyse von TRPV1-spezifischen Wirkstoffen

TRPV1 ist ein polymodal aktivierbarer Kationenkanal, der neben der Nozizeption an vielen weiteren zellulären Prozessen beteiligt ist. Fehlfunktionen oder eine gestörte Regulation des TRPV1-Ionenkanals sind mit verschiedenen Krankheiten, wie beispielsweise Arthritis, Atemwegserkrankungen, Blasenfunktionsstörungen, Diabetes, entzündliche Darmerkrankungen und Tumoren assoziiert. Aufgrund seiner vielfältigen Funktionen in Physiologie und Pathophysiologie stellt der TRPV1-Ionenkanal ein attraktives pharmakologisches Zielmolekül für die Wirkstoffentwicklung dar. Für den TRPV1-Ionenkanal wurden bereits Agonisten und Antagonisten entwickelt, die jedoch aufgrund von Nebenwirkungen klinisch nicht einsetzbar sind. Die Nutzung des TRPV1-Ionenkanals als therapeutisches Zielmolekül bedingt daher die Entwicklung neuer TRPV1-spezifischer Wirkstoffe. Für die Identifizierung und Validierung werden geeignete Testsysteme benötigt, die eine hohe Aussagekraft hinsichtlich der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die in vivo Situation besitzen.
Dazu wurden in der vorliegenden Dissertation zellbasierte 2D-Monolayer und 3D- Sphäroid-Testsysteme entwickelt, mit denen pharmakologische Aktivitäten von neuen TRPV1-spezifischen Substanzen direkt im zellulären Kontext analysiert werden können. ... mehrFür die Entwicklung der zellulären Assays wurde der humane TRPV1-Kanal als Fusionsprotein mit einem C-terminalen mCherry-Fluoreszenztag in einem Dozyklin-induzierbaren Expressionssystem (Tet-On 3G) in CHO-K1-Zellen stabil exprimiert (CHO-I-hTRPV1-Zellmodell). Die sehr gute Regulierbarkeit der TRPV1-Expressionshöhe wurde für verschiedene Doxyzyklin-Konzentration gezeigt. Die Wildtyp-CHO-K1-Zellen exprimieren keinen endogenen TRPV1-Ionenkanal, so dass TRPV1-vermittelte zelluläre Antworten auf den heterolog exprimierten, humanen TRPV1-Ionenkanal (hTRPV1) zurückgeführt werden konnten. Durch Aktivierung bzw. Inhibierung des TRPV1-Ionenkanals und der fluorimetrischen Messung der damit verbundenen Änderung der intrazellulären Calcium-Konzentration [Ca2+]i konnte nachgewiesen werden, dass der heterolog exprimierte hTRPV1-Ionenkanal im CHO-Zellmodell funktionell exprimiert wird. Die Calcium-Messungen wurden sowohl fluoreszenzmikroskopisch auf Einzelzellebene als auch in einem Mikroplattenreader-basierten Assay durchgeführt. Mit Hilfe des mCherry-Fusionsproteins wurde gezeigt, dass der hTRPV1-Ionenkanals in den CHO-Zellen in der Plasmamembran sowie in Endomembranen lokalisiert, was der subzellulären Lokalisation des endogenen hTRPV1-Ionenkanals entspricht. Die Validierung der zellulären 2D- und 3D-CHO-I-hTRPV1-Testsysteme erfolgte über die Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen mit jeweils fünf bekannten Agonisten und Antagonisten des TRPV1-Ionenkanals. Die ermittelten pharmakologischen Eigenschaften des rekombinanten TRPV1-mCherry-Fusionsproteins sind mit in der Literatur beschriebenen Eigenschaften von endogen bzw. heterolog exprimierten TRPV1-Ionenkanälen vergleichbar. Im Vergleich der 2D- und 3D-Testsysteme wurden im Sphäroid-Zellmodell signifikant niedrigere EC50-Werte für die Agonisten Capsaicin, RTX und NOD, als auch eine höhere Maximalwirkung für NADA, RTX und NOD ermittelt. Zwei Antagonisten (SB-366791 und RR) zeigten im 3D-Sphäroid-Modell eine signifikant niedrigere inhibitorische Potenz als im Monolayer.
Zusätzlich zur pharmakologischen Validierung wurde durch die Bestimmung des Z‘-Faktors das Potenzial der entwickelten 2D- und 3D-CHO-I-hTRPV1-Testsysteme für den Einsatz als Hochdurchsatz-Screening-System für die Wirkstoffsuche beurteilt. Für das 2D-Testsystem wurde ein Z‘-Wert von 0,66 ± 0,09 ermittelt, was den Assay als ein sehr gutes Testsystem für die Wirkstofffindung in Hochdurchsatzverfahren ausweist. Für das 3D-Testsystem wurde ein Z‘-Faktor von 0,45 ± 0,05 ermittelt, der zwar niedriger als der Z‘-Faktor des 2D-Testsystems ist, aber noch die minimalen Anforderungen an ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren erfüllt. Zusammenfassend belegen die Ergebnisse, dass das hier entwickelte CHO-I-hTRPV1-Zellmodell in Verbindung mit der fluorimetrischen Messung der [Ca2+]i als sensitives 2D- und 3D-Testsystem für die pharmakologische Analyse von TRPV1-spezifischen Wirkstoffen entwickelt werden konnte.
Für die Entwicklung krankheitsrelevanter TRPV1-Modelle wurden 2D- und 3D-Zellkulturmodelle von verschiedenen Brustkrebszelllinien etabliert und pharmakologisch hinsichtlich des TRPV1-Ionenkanals charakterisiert. Capsaicin-induzierte Calcium-Reaktionen konnten in allen getesteten Zelllinien nachgewiesen werden. Eine TRPV1-vermittelte Erhöhung der Viabilität wurde in zwei Brustkrebszellllinien unabhängig des Kultivierungssystems (2D vs. 3D) detektiert.