Abstract:
Neue Erkenntnisse im Bereich der Biotechnologie ermöglichen es Vorgänge im Körper bis ins kleinste Detail zu verstehen und bei Abweichungen regulierend einzugreifen. Eine Art des Eingreifens ist die Behandlung von Krankheiten mit rekombinanten Proteinen, wie Antikörpern oder Enzymen. Die Wirkspezifität dieser biopharmazeutischen Wirkstoffe ermöglicht die Behandlung von bisher schwer zu therapierenden Erkrankungen wie maligne Neoplasie oder multiple Sklerose. Je komplexer der Wirkmechanismus des eingesetzten Medikaments ist, desto komplexer ist das Biomolekül welches zum Einsatz kommt. ... mehrDiese Komplexität hat Auswirkungen auf die Prozessierbarkeit des Biopharmazeutikums. Insbesondere die kolloidale und konformelle Stabilität des Zielmoleküls ist eine Herausforderung während des Herstellungsprozesses, des Aufreinigungsprozesses und der Formulierung. Proteinlösungsinstabilitäten können Prozessverzögerungen oder im schlimmsten Fall lebensbedrohliche Immunreaktionen im Körper des Patienten verursachen und sind daher wichtig zu kontrollieren.
Die Stabilität des Biomoleküls ist abhängig von der Beschaffenheit des Moleküls an sich sowie den Umgebungsbedingungen. Ein Lösungsparameter mit hohem Einfluss ist die Proteinkonzentration. Um die Prozesskosten zu senken und die Verabreichung des Medikaments zu erleichtern, wird die Konzentration des Zielmoleküls während der Verarbeitung und der Formulierung maximal erhöht. Die Erhöhung der Proteinkonzentration hin zu hochkonzentrierten Bedingungen hat nicht nur Auswirkungen auf die Proteinstabilität sondern erhöht auch die mögliche Anzahl von Mechanismen, die diese beeinflussen. Der Parameterraum vergrößert sich mit dem zunehmenden Einfluss von hauptsächlich attraktiven kurzreichweitigen Wechselwirkungen. Zusätzlich werden, durch die Erhöhung der Molekülzahl, die in idealer Lösung vorliegenden zweidimensionalen Protein-Wechselwirkungen mehrdimensional, sodass eine Charakterisierung mittels herkömmlicher prädiktiver Analysemethoden an ihre Grenzen stößt. Um die Lösungsstabilität von hochkonzentrierten Proteinlösungen und Formulierungen sicherzustellen ist es wegen fehlender prädiktiver Methoden gängige Praxis, das Molekül von Interesse unter variierenden Lösungsbedingungen über eine Zeit von 12-24 Monaten zu lagern und daraufhin auf Entfaltung oder Aggregation zu analysieren. Diese Methode ist zeit- und kostenintensiv. Mit Hilfe dieser Methode wird außerdem ausschließlich Wissen über den Stabilitätsbereich gewonnen, allerdings keine Informationen über den Mechanismus dahinter, welcher für die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf andere Moleküle oder Lösungsbedingungen von Bedeutung wäre.
Es werden innovative, neuartige Methoden gefordert, welche das Verhalten von Proteinen in hochkonzentrierten Bereich besser charakterisieren können. Außerdem gilt es Parameter zu evaluieren, die eine Vorhersage der Lösungsstabilität auch im hochkonzentrierten Bereich ermöglichen. Eine vielversprechende Methode zur Analyse komplexer Flüssigkeiten, wie hochkonzentrierte Proteinlösungen, ist die Rheologie.
Rheologie ist die Lehre der fließenden Stoffe und beschreibt damit das Fließverhalten und die Verformung von Materie. Nach der Lehre der Rheologie werden Versuchsobjekte nach ihrer Elastizität beziehungsweise ihrer Viskosität unterteilt. Bei einem ideal elastischen Körper ist das Ausmaß der Deformation direkt proportional zur eingesetzten Spannung und der Körper bewegt sich nach der Krafteinwirkung in seine Ausgangslage zurück. Ein ideal viskoser Körper reagiert auf eine Krafteinwirkung mit einer zeitlich verzögerten Deformation und die Verformung ist irreversibel. Proteinlösungen verhalten sich viskoelastisch. Das bedeutet, dass sie nach Aufbringung einer Kraft nur unvollständig relaxieren, also teilweise elastisches, teilweise viskoses Verhalten aufweisen. Die viskoelastischen Eigenschaften von Fluiden sind von der Größe und Anzahl der Moleküle in Lösung, deren Flexibilität, Vernetzungs- und Interaktionsgrad abhängig. Die Änderungen des viskoelastischen Verhaltens von Fluiden können sehr genau durch das Speicher- und das Verlustmodul (G' und G'') beschrieben werden. Im Gegensatz zu Industriezweigen wie der Lebensmittel- oder Kosmetikindustrie ist die Charakterisierung des viskoelastischen Verhaltens von Proteinlösungen in der biopharmazeutischen Industrie noch nicht etabliert.
Ziel dieser Arbeit war es deshalb, das Potenzial der Rheologie für die biopharmazeutische Prozess- und Formulierungsentwicklung zu untersuchen. Hierbei lag der Fokus auf der Charakterisierung des viskoelastischen Verhaltens hochkonzentrierter Proteinlösungen. Darüber hinaus wurden die ermittelten rheologischen Parameter auf ihre Eignung zur Vorhersage der Langzeitstabilität von Proteinlösungen geprüft. Um den prädiktiven Ansatz zu verfeinern, wurden in einem nächsten Schritt die rheologischen Messungen mit Ergebnissen orthogonaler Analytikmethoden kombiniert. Darüber hinaus wurde die Mikrorheologische Technik durch ein Tracer-Partikel-Screening optimiert.
Vorbereitend zur rheologischen Charakterisierung, wurde die Handhabung und Standardanalytik von hochkonzentrierte Proteinlösungen optimiert. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung eines analytischen Mikrofluidik-Chips der die automatisierte Messung der Proteinkonzentration mittels UV Absorption ermöglicht.
Bei kommerziell erhältlichen Geräten, für die Bestimmung der Proteinkonzentration, ist entweder die Hochdurchsatzkompatibilität oder der Messbereich limitierender Faktor. Für die exakte Bestimmung der Proteinkonzentration, müssen daher hochkonzentrierte Proteinlösungen um ein vielfaches verdünnt werden, was bei geringem Probenvolumen zu hohen Abweichungen und Zeitverlust führen kann. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit für die automatisierte Hochdurchsatzmessung im Mikrolitermaßstab ein Silikon-Chip entwickelt, der die direkte Bestimmung der Absorption von hochkonzentrierten Proteinlösungen zulässt. Der Chip wurde nach ICH Guidelines validiert und die Anwendung mit Hilfe einer Fallstudie demonstriert. Die Verwendung des Chips ermöglicht Absorptionsmessungen im 96-well kompatiblen Maßstab in einem Protein-Konzentrationsbereich von 0.1-100~mg/ml mit einer Genauigkeit von 99.2 %.
Als zweiter vorbereitender Schritt wurde ein Roboter-basiertes Verfahren zur Generierung von Proteinphasendiagrammen auf hochkonzentrierte Proteinlösungen angepasst. Die so erzeugten Proteinphasendiagramme wurden verwendet, um das Langzeitstabilitätsverhalten der Proteine mit den rheologischen Messungen zu vergleichen. Diese Methodik wurde zur Herstellung von mehr als 20 Phasendiagrammen mit variierender Proteinart, Proteinkonzentration, Additivart und Konzentration sowie variierendem pH-Wert verwendet.
Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt in der rheologischen Charakterisierung und der Interpretation der erhaltenen viskoelastischen Eigenschaften von Proteinlösungen unter wechselnden Prozess- und Formulierungsbedingungen. Für die schwach viskoelastischen Proteinlösungen wurden für die Ermittlung der rheologischen Parameter Oszillationsversuche im Hochfrequenzbereich durchgeführt. Hierbei wurden G' und G'' über einen Frequenzrampe bei oszillierender Quetschströmung ermittelt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die Definition geeigneter viskoelastischer Parameter zunächst ein rheologisches Screening mit dem Modellprotein Lysozym aus Hühnerei in einem Konzentrationsbereich von 100-225 mg/ml unter variierenden Lösungsbedingungen durchgeführt. Mit Hilfe dieses Screenings konnte gezeigt werden, dass hochkonzentrierte Proteinlösungen ein für Polymere charakteristisches viskoelastisches Verhalten aufweisen. Des Weiteren wurde der ωCO Wert aller vermessenen Proben zum Zeitpunkt t0 berechnet und erfolgreich mit dem Phasenverhalten von Lysozym nach 40 Tagen Inkubationszeit (t40) korreliert. Das groß angelegte Screening ermöglichte es eine Löslichkeitsgrenze für Lysozym basierend auf den ωCO Werten zu ziehen. Der ermittelte ωCO Grenzwert schafft die Voraussetzung die Langzeit-Lösungsstabilität von Lysozym, mit nur einer rheologischen Messung, direkt nach Probenpräparation bestimmen zu können.
In einem nächsten Schritt wurde der prädiktive rheologische Ansatz mit Molekulardynamik (MD)-Simulationen kombiniert. Die in dieser Arbeit eingesetzten MD-Simulationen geben Aufschluss über die Oberflächencharakteristik der untersuchten Proteine und können somit die Langzeit-Lösungsstabilität, welche durch den rheologischen Ansatz vorhergesagt wurde, begründen. Hierzu wurde eine Fallstudie mit Glutathione-S-Transferase in ihrer Reinform und fusioniert mit einem potentiell löslichkeitserhöhenden Tag (Cherry-TagTM) unter variierenden Lösungsbedingungen durchgeführt. Die rheologische Charakterisierung der beiden Proteine ermöglichte eine präzise Vorhersage der kolloidalen und konformellen Lösungsstabilität. Das rheologische Screening gab Aufschluss über den stark löslichkeitserhöhenden Charakter des verwendeten Cherry-TagsTM. In Kombination mit den Ergebnissen der MD-Simulation, konnte die Löslichkeitserhöhung auf eine starke Änderung der Oberflächenladung und der Oberflächenhydrophobizität, hervorgerufen durch den Cherry-Tag, zurückgeführt werden.
Monoklonale Antikörper und ihre Untergruppen besitzen das am schnellsten wachsende Anwendungsfeld in der pharmazeutischen Industrie. Durch die Komplexität und die Größe dieser Moleküle wird deren Langzeitstabilität als besonders kritisch eingestuft. Erschwerend kommt hinzu, dass neue Applikationsformen Antikörpertiter von mehr als 100 mg/ml in der Endformulierung voraussetzen. Um diesen Herausforderungen entgegenzutreten, wurde die Untersuchung der Viskoelastizität auf Antikörper unter prozessrelevanten Bedingungen übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass viskoelastische Messungen sehr sensitiv gegenüber Änderungen der Lösungsbedingungen von Antikörperformulierungen sind, und dass der vorgestellte Parameter ωCO die kolloidale Stabilität des untersuchten Antikörpers exakt vorhersagen kann. Die rheologische Analytik wurde zudem mit etablierten, orthogonalen Methoden zur Charakterisierung der Proteinoberfläche, der Proteinmobilität und thermischen Stabilitätsuntersuchungen verknüpft. Die Anwendung der so entstandenen analytischen Toolbox gewährleistet eine präzise Vorhersage der Proteinlösungsstabilität und ist somit ein wichtiger Beitrag für die schnelle Entwicklung stabiler und sicherer Formulierungen von Biopharmazeutika.
Die Anwendung mechanische Hochfrequenz-Rheologie, die für die oben aufgeführten Screenings verwendet wurde, ist in der pharmazeutischen Industrie nicht etabliert, und eine entsprechendes Gerät ist derzeit nicht im Handel erhältlich. Daher wurde parallel zur Verwendung der mechanischen Rheologie die Optimierung der mikrorheologischen Technik vorangetrieben. Bei mikrorheologischen Messungen werden die Parameter G' und G'' mittels dynamischer Lichtstreuung bestimmt. Um reproduzierbare, korrekte Ergebnisse zu erzielen, ist es erforderlich, dass die Tracerpartikel nicht mit den Proteinen in Lösung wechselwirken. In einer Studie wurden daher die Oberflächencharakteristik und die Interaktionsneigung vier unterschiedlicher Tracerpartikel untersucht. Festgestellt wurde, dass die Wahl des Tracerpartikels einen großen Einfluss auf die rheologischen Ergebnisse hat. Ein intern hergestelltes Polystyrolpartikel mit modifizierter Oberfläche stellte sich als einzig geeigneter Tracerpartikel für die rheologische Untersuchung von in dieser Studie untersuchten Proteinlösungen heraus. Mit diesem konnte eine hohe Messgenauigkeit und eine gute Korrelation mit den Ergebnissen mechanischer Rheometer erreicht werden.
Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit ein umfassendes Bild der viskoelastischen Eigenschaften von hochkonzentrierten Proteinlösungen gewonnen. Im Speziellen konnte eine ausführliche Charakterisierung hochkonzentrierter Proteinlösungen erreicht und ein rheologischer Parameter, ωCO eingeführt werden, der prädiktive Aussagen über die Lösungsstabilität der hochkomplexen Lösungen zulässt. Der eingeführte und validierte Parameter ermöglicht, gerade in Kombination mit weiteren hier verwendeten analytischen Verfahren, eine schnelle und sichere Charakterisierung von viskoelastischen Fluiden und kann so auch in anderen Forschungsdisziplinen Anwendung finden.
Abstract (englisch):
New insights in the field of biotechnology allow the understanding of processes in the body down to the smallest detail and to intervene in the event of deviation.
One type of intervention is the treatment of diseases with recombinant proteins, such as antibodies or enzymes. The efficacy of these biopharmaceutical active substances makes it possible to treat diseases which have hitherto been difficult to deal with, such as malign neoplasm or multiple sclerosis. The more complex the mode of action of the drug applied, the more complex is the biomolecule of choice. This complexity has an impact on the processability, formulation and application of biopharmaceuticals. ... mehrIn particular, the colloidal and conformational solution stability is a challenge during their shelf life. Protein solution instabilities can cause process delays or in a worst case scenario life-threatening immune reactions in the patient`s body and are thus important to control.
The solution stability is dependent on the molecular properties and the environmental conditions. A high-impact parameter is the protein concentration. To save process costs and to simplify drug administration, the concentration of the target molecule is maximally increased during processing and formulation. The increase in protein concentration to highly concentrated conditions does not only affect protein stability itself but also increases the possible number of stability-influencing parameters. Due to the reduced distance between the molecules at high concentrations long- as well as short-range forces do have an impact on the protein solution behavior. The complex interplay of the resulting interactions are difficult to depict. Additionally, as a result of the increased number of molecules in solution, the two-dimensional protein interactions occurring in an ideal dilute solution become multidimensional, so that a characterization by conventional predicting methods reaches its limits. Due to the lack of an established predicting analytical tool it is therefore common practice to store the molecules of interest under varying solution conditions over a period of 12-24 months and analyze the samples for protein unfolding or aggregation, afterwards. This method is precise and ensures the safety of the patient but is time and cost intensive. Furthermore, with the help of this method, only knowledge about the stability range is gained, but no information is available on the mechanisms of protein-protein or protein-solvent interactions. Thus the transfer of the results to other molecules or solution conditions is limited. Novel analytical methods are demanded, which enable a better characterization of protein solution behavior and parameters which allow a direct prediction of protein solution stability even in the highly concentrated regime.
A promising method for analyzing complex fluids such as highly concentrated protein solutions is rheology.
Rheology is the science of fluent materials and describes the flow behavior and the deformation of matter. According to rheology, experimental objects can be divided according to their elasticity and their viscosity. In the case of an ideally elastic body, the extent of the deformation is directly proportional to the applied stress, and the body moves back into its initial position after applied force. An ideally viscous body reacts to an effective force with a time-delayed deformation and the deformation is irreversible. Protein solutions behave viscoelastic. This means that after application of a force, they only partially relax and accordingly demonstrate partially elastic, partially viscous behavior. The viscoelastic properties of protein solutions depend on the size and number of molecules in solution, their flexibility, the degree of cross-linking, and the degree of molecule-molecule and molecule-solvent interactions. The changes in the viscoelastic behavior of fluids can be described very precisely by the measurable storage and loss moduli (G’ and G’’). In contrast to industrial branches such as the food or cosmetics industry, the characterization of the viscoelastic behavior of protein solutions has not yet been established in the biopharmaceutical industry.
The aim of this thesis is therefore to investigate the potential of rheology for the biopharmaceutical process and formulation development. Focusing on the characterization of the viscoelastic behavior of highly concentrated protein solutions. In addition, the determined rheological parameters were evaluated for their suitability to predict the long-term stability of these complex fluids. To refine the predictive approach, in a next step, the rheological measurements were combined with results of orthogonal analyzing tools. Furthermore, the microrheological technique was optimized by a tracer particle screening.
Prior to the rheological characterization, handling and standard analytics for studying highly concentrated protein solutions were optimized. In the first part of the thesis an analytical microfluidic device is presented, which enables the automated determination of protein concentration by means of UV absorption.
Commercially available devices for the determination of protein concentration are limited either by high-throughput compatibility or the measuring range. For the exact determination of the protein concentration, highly concentrated protein solutions must therefore be diluted several times. The time consuming dilution procedure can lead to unacceptable standard deviations especially when handling small sample volumes. It is for this reason that a disposable silicone chip was developed for automated high-throughput measurements at microliter scale. The device allows the direct measurement of UV absorption in a wide protein concentration range by the use of microfluidic channels, which enable a layer thickness of less than 1 mm. The device was validated according to ICH guidelines and the application was demonstrated by a case study on an automated liquid handling station. The use of the device allows high-throughput absorption measurements in a protein concentration range of around 0.1-100 mg/ml with an accuracy of 99.2 %.
As a second preparatory step a robot-based method for generating protein phase diagrams was adapted to the handling of highly concentrated protein solutions. The protein phase diagrams generated in this way were used to compare the long-term stability behavior of studied proteins with the rheological measurements. With this automated platform more than 20 phase diagrams with different protein types, protein concentrations, additives types and concentrations, and changing pH values could be screened.
The main focus of this work was the rheological characterization and the interpretation of obtained viscoelastic properties of protein solutions under varying process and formulation conditions. For the comparatively weak viscoelastic protein solutions, oscillating experiments were performed in the high-frequency range for the determination of the rheological parameters. In this respect, G' and G'' were determined over a frequency ramp with oscillatory squeeze flow.
Within the framework of this work, a rheological screening of the model protein lysozyme from chicken egg white in a concentration range of 100-225 mg/ml and varying solution conditions was carried out. This screening initially served to evaluate suitable viscoelastic key parameters. The viscoelastic moduli G' and G'' were determined over a frequency range of 100-40000 rad/sec and the crossover point of the two resulting curves calculated. The frequency value of the detected crossover point, ωCO, was selected to be correlated with the protein phase behavior. It was shown that highly concentrated protein solutions show a characteristic viscoelastic behavior which is sensitive towards changing solution conditions. Furthermore, the ωCO values of all samples, determined directly after sample preparation (t0), could successfully be correlated with the phase behavior of lysozyme after 40 days of incubation (t40). The large-scale screening allowed to draw a solubility limit for lysozyme based on ωCO values at 20000 rad/sec. The calculated ωCO limit provides the prerequisite for the prediction of the long-term solution stability of lysozyme, with only one rheological measurement, conducted directly after sample preparation.
In a next step, the predictive rheological approach was combined with molecular dynamics (MD) simulations. The MD simulations used in this work provide information on the surface characteristics of the proteins being studied and can therefore explain the long-term behavior of protein samples predicted by the rheological approach. For this purpose, a case study with Glutathione-S-Transferase was performed in its pure form and fused with a potentially stabilizing tag (Cherry-TagTM) under varying solution conditions. The rheological characterization allowed a precise prediction of the colloidal and conformational solution stability of both studied proteins. The rheological screening revealed the strong solubility-enhancing nature of the Cherry-TagTM. In combination with the results of the MD simulations, the solubility increase could be attributed to a pronounced change in the protein surface charge and protein surface hydrophobicity caused by the Cherry-TagTM.
Monoclonal antibodies and antibody related species belong to a quickly expanding field of application in the pharmaceutical industry. Due to the complexity and size, the long-term stability of this molecule class is classified as particularly critical. This challenging situation is aggravated by the fact that new application forms require antibody titers of more than 100 mg/ml. In order to confront these challenges, the study of viscoelasticity was transferred to antibodies under process-relevant conditions. It was shown that viscoelastic measurements are very sensitive to changes in the solution conditions of antibody formulations and that the parameter ωCO enables the prediction of the colloidal stability of the antibody under investigation. The rheological analysis was also linked with established, orthogonal methods for the characterization of the protein surface, the protein mobility and thermal stability studies. The application of the resulting analytical toolbox ensures a precise prediction of the protein solution stability and is therefore an important contribution to the rapid development of stable and safe antibody formulations.
The mechanical high-frequency rheology used for the above listed screenings is not common in the pharmaceutical industry and a corresponding device is currently not commercially available. Therefore, parallel to the mechanical measurements the optimization of the microrheological technique was expedited. In the case of microrheological measurements, the parameters G' and G'' are determined by means of dynamic light scattering. To gain reproducible, correct results it is required that the tracer particles do not interact with the proteins in solution. Therefore, the surface characteristic and the interaction tendency of four different potential tracer particles were investigated under changing buffer conditions. It was found that the choice of the tracer particle has a significant influence on the rheological results. An internally developed polystyrene particle with a modified surface turned out to be the only suitable tracer particle for the microrheological measurements of protein solutions tested. With this particle type, a high measurement accuracy and a good correlation with the results of mechanical rheometers could be achieved.
In summary, the emphases of this work have been extensively studied to obtain a comprehensive picture of the viscoelastic properties of highly concentrated protein solutions. In particular, the sensitivity of viscoelastic parameters against changing protein solution conditions has been demonstrated and a rheological parameter, ωCO, has been introduced that allows predictive statements about the solubility of proteins in highly complex solutions. The introduced and validated parameter, particularly in combination with further analytical methods used here, enables a fast and reliable characterization of viscoelastic fluids and can thus also be applied in other research disciplines.
