Abstract:
Der programmierte Zelltod (programmed cell death, PCD) ist ein unverzichtbarer Vorgang, welcher sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren durch ein intrazelluläres Programm vermittelt wird. Vor allem im pflanzlichen Immunitätssystem ist er als letztes Mittel eine unentbehrliche Strategie, um im Rahmen einer sogenannten hypersensitiven Antwort (hypersensitive response, HR) die Ausbreitung von biotrophen Pathogenen zu unterbinden. Als fortgeschrittener Zelltodmechanismus erscheint die hypersensitive Antwort häufig als Gipfelpunkt des zweiten Immunitätsniveaus einer Pflanze, die als Effektor-vermittelte Immunität (effector-triggered immunity, ETI) bezeichnet wird und ein Zeichen höherer Resistenz darstellt. ... mehrUnsere bisherige Arbeit hat bereits eine Cystein-abhängige Protease-Genfamilie in der Weinrebe identifiziert, eine so genannte Metacaspase (MC), die eine wesentliche Rolle bei Prozessen des programmierten Zelltods in der Entwicklung von Pflanzen spielt. Ziel dieser Doktorarbeit ist es, zentrale MC-Genkandidaten zu screenen, die auf den ETI-induzierten HR-Prozess reagieren und die zelluläre Funktion und den entsprechenden Regulationsmechanismus der Kandidaten zu verstehen. Die Doktorarbeit besteht wie folgt aus drei progressiven Teilen.
Wir verwendeten ein typisches biotrophes Pathogenisolat, Plasmopara viticola, als HR-Elicitor auf Blattscheibenbioassays, um die Unterschiede der nekrotischen Zone während der Infektion von neun Genotypen auf Weinrebenblätter zu beobachten. Zwei gegensätzliche Genotypen wurden untersucht: Das Kultivar "Müller Thurgau" steht für einen anfälligen Genotyp, wohingegen Vitis rupestris für einen HR-resistenten Genotyp steht. Eine weitere Genexpressionsanalyse zeigte, dass nach der Infektion nur VrMC2 und VrMC5 von V. rupestris zunehmend exprimiert wurden, was 24 h vor dem Auftreten der hypersensitive Antwort erfolgte. Daher wurden diese beiden Gene als Kandidaten ausgewählt.
In einer Suspensionszelllinie wurde Harpin als ein wirksamer, die hypersensitive Antwort auslösender Elicitor eingesetzt, der den Zelltod spezifisch für V. rupestris und “Pinot Noir”induzieren konnte. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass nach 24 h mit 18 µg / ml Harpinbehandlung VrMC2 und VrMC5 entsprechend hochreguliert wurden. Dieses Ergebnis entsprach unseren früheren Ergebnissen auf Blattscheiben. Bezüglich ihrer zellulären Funktionen wurden VrMC2 und VrMC5 durch heterologe Expression in BY-2 Tabakzellen charakterisiert. Die subzellulären Lokalisierungsstudien zeigten, dass sich VrMC2 am endoplasmatischen Retikulum (ER) um die Kern herum und VrMC5 im Zytoplasma und dem Kernbereich befand. Dies legt nahe, dass in der Weinrebe zwei verschiedene Typen von Metacaspasen wahrscheinlich die Rolle des programmierten Zelltods in verschiedenen subzellulären Orten in der Zelle übernehmen. Darüber hinaus zeigte ein Zellmortalitätsassay, dass beide VrMC2- und VrMC5-BY-2-Überexpressionslinien stark auf den durch Harpin-induzierten Zelltod reagierten. Darüber hinaus ist diese Mortalität signalabhängig, was durch die Zugabe von exogenem Methyljasmonat (MeJA), ein wichtiger Überträger der basalen Immunität, oder Diphenyleniodonium (DPI), einem Inhibitor von Nicotinamid-Adenin- Dinukleotid-Phosphat-Wasserstoff (NADPH) Oxidasen, welche apoplastisches Superoxid erzeugen, vermindert werden konnte.
Die 5'-Upstream-Sequenz-Promotoren von MC2 (pMC2) und MC5 (pMC5) wurden aus beiden Kultivaren, "Müller Thurgau" und V. rupestris, kloniert, um den durch Genexpression regulierten Mechanismus weiter zu untersuchen. Die Verteilung der auf die Abwehrreaktion bezogenen cis-Elemente von pMC2 und pMC5 wurde in den zwei Genotypen weiter analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass es fünf verschiedene Arten cis-Elementen gibt, die sowohl auf pMC2 als auch auf pMC5 verteilt sind, wie z. B. die W-Box, die TC-reiche Region und das GT-1-Motiv. Die Gesamtelementanzahl von pVrMC2 und pVrMC5 ist höher als die Anzahl von pVvMC2 und pVvMC5. Nicht zuletzt wurde mit Hilfe eines Dual-Luciferase-Systems zum Nachweis der Promotoraktivität von pVrMC2 und pVrMC5 gezeigt, dass nach der Harpinbehandlung sowohl die Aktivität von pVrMC2 als auch die von pVrMC5 zumeist verdoppelt wurden. Jedoch zeigte pVrMC2 keine Antwort auf MeJA. Außerdem verringerte sich sogar die pVrMC5-Aktivität durch Zugabe von MeJA. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die VrMC2- und VrMC5-Genexpressionsmuster teilweise durch ihre entsprechenden Promotoraktivitäten reguliert wurden.
Abstract (englisch):
In both plants and animals, programmed cell death (PCD) is an indispensable process that is mediated by an intracellular program. Especially in plant defence response, PCD works as a last resort to block the spread of biotrophic pathogens and this phenomenon is called hypersensitive response (HR) or hypersensitive cell death. As an advanced suicide defence mechanism, HR often appears as a culmination of a plant’s second immunity level, termed an effector-triggered immunity (ETI), and a mark of higher resistance. Our previous work has already identified one cysteine-dependent protease gene family in grapevine, a so-called Metacaspase (MC), which is reported to play an essential role in plant developmental PCD processes. ... mehrIn this study, the scope is to screen central MC gene candidates which respond to the ETI-induced HR process and understand the cellular function and related regulation mechanism of the candidates. The whole study consists of three progressive parts as follows.
As a first step, two extreme genotypes differed in their HR response elicited by a typical biotrophic pathogen isolate plasmopara viticola were selected by screening 9 genotypes of the host grapevine using leaf discs bio-assay. As a result, V. vinifera cv. ‘Mueller Thurgau’ stands for susceptible genotype and V. rupestris stands for HR-resistant genotype were chosen. By comparing the expression profile of MC genes, it is shown that the expression level of VrMC2 and VrMC5 in V. rupestris increased steadily within 24 hours after infection in V. rupestris not in the susceptible cultivar Mueller Thurgau.
In order to have a detailed understanding of VrMC2 and VrMC5, suspension cell line of V. rupestris and cv ‘Pinot Noir’ was employed in the following studies in which HR can be induced by harpin elicotor. Gene expression analysis showed that VrMC2 and VrMC5 were up-regulated after 24h in response to harpin treatment at 18µg / ml. This result was in accordance with our former results on leaf discs. Subcellular localization of VrMC2 and VrMC5 has been characterized upon heterologous expression in tobacco BY-2 cells which is much easier to transform. Fluorescent microscopy showed that VrMC2 located on Endoplasmic reticulum (ER) around the nuclear zone, and VrMC5 located in the cytoplasm and nucleus. These results suggest that there are two different types of grape MCs probably involved PCD and function in different subcellular location. Moreover, a cell mortality assay showed both overexpressed VrMC2 and VrMC5 BY-2 cell lines responded highly to harpin induction (activating defence-related cell death). In addition, this mortality is signal-dependent, which could be mitigated by either the addition of exogenous methyljasmonate (MeJA; an important transducer of basal immunity) or diphenyleneiodonium (DPI), an inhibitor of Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen (NADPH) oxidases that generate apoplastic superoxide.
The 5’ upstream sequences promoters of MC2 (pMC2) and MC5 (pMC5) were cloned from both cv. ‘Mueller Thurgau’ and V. rupestris to further investigate the gene expression-regulation mechanism. The distribution of defence-related cis-elements was further analysed from pMC2 and pMC5 between two genotypes. Results showed there are five different kinds of key defence-related cis-elements distributed on both pMC2 and pMC5, such as the W box, TC-rich region and GT-1 motif. The total element numbers from pVrMC2 and pVrMC5 are higher than the numbers from pVvMC2 and pVvMC5. Last but not least, by using a dual-luciferase system to detect the promoter activity of pVrMC2, pVrMC5, the results revealed that both pVrMC2 and pVrMC5 activities were mostly doubled after harpin treatment. However, pVrMC2 showed no response to MeJA, and even pVrMC5 activity decreased by adding MeJA. These findings verified that the VrMC2 and VrMC5 gene expression trends were partially regulated by their corresponding promoter activities.
