Dual-located kinesin - A class XIV kinesin that can enter the nucleus

Das pflanzliche Zytoskelett besteht aus zwei verschiedenen Arten von Proteinpolymeren: Aktinfilamente und Mikrotubuli. Sie tragen zur zelleigenen Richtung (Zellachse, Zellpolarität) von Pflanzenzellen bei, welche die Morphogenese bis hin zur organismischen Ebene bestimmt. Motoren sind eine Art von Proteinen, die an das Zytoskelett binden und die Energie aus der ATP-Hydrolyse verwenden können, um z.B. Vesikel entlang des Zytoskeletts in eine gewisse Richtung zu bewegen und zu transportieren. Während Myosine Motoren sind, die entlang von Aktinfilamenten laufen, bewegen sich Kinesine und Dyneine entlang von Mikrotubuli. ... mehrKonventionelle Kinesine bewegen sich in Richtung des Plus-Endes der Mikrotubuli, während Dyneine sich in Richtung des Minus-Endes bewegen. Eine der auffälligsten Besonderheiten der pflanzlichen Motorproteine ist jedoch das Fehlen von in Richtung Minus-Ende laufenden zytoplasmatischen Dyneinmotoren in den meisten Gymnospermen und in allen Angiospermen. Im Gegensatz dazu wurde eine spezifische Klasse von in Richtung Minus-Ende laufenden Kinesinen in Landpflanzen entdeckt, die im Allgemeinen als Klasse-XIV-Kinesine bezeichnet werden. So liegt es nahe, dass einige der Funktionen von Dyneinen von Kinesinen der Klasse- XIV übernommen wurden.
In dieser Doktorarbeit wurde die subzelluläre Funktion eines als OsDLK bezeichneten Klasse-XIV-Kinesins untersucht. Die heterozygoten Reismutanten zeigten eine Verzögerung in der Koleoptilenstreckung im Vergleich zu den Keimlingen des Wildtyps. Die homozygoten Mutanten konnten dieses verzögerte Wachstum auch während mehrerer Generationen nicht aufholen. Später zeigte dlk ein relativ hohes Transkriptionsniveau während der ersten 4 Tage nach der Keimung, was auf eine wichtige Rolle von OsDLK während des frühen Stadiums der Reiskeimung hindeutet.
Um einen Einblick in die subzelluläre Funktionen zu erhalten, wurde OsDLK, welches mit einem fluoreszierenden Reporter fusioniert wurde, in BY-2 Tabakzellen (Nicotiana tabacum) überexprimiert. Wir zeigten durch ein In-vitro-sliding Assay, dass es die Fähigkeit hat, an Mikrotubuli zu binden und sich in Richtung Minus-Ende zu bewegen.
Die Überexpression dieser GFP-Fusion stimulierte die Zellproliferation und verzögerte den Übergang in die Zellexpansion. Durch die Synchronisierung des Zellzyklus konnten wir zeigen, dass der Übergang in die Metaphase in der Überexpressionslinie verzögert wurde, während die späteren Phasen deutlich beschleunigt wurden.
Die Lokalisierung von OsDLK während des Zellzyklus ergab, dass das Fusionsprotein neu verteilt wurde und mit den zellwandnahen Bereichen der Mikrotubuli (kortikale Mikrotubuli, Phragmoplast) kolokalisierte. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass OsDLK in zwei Populationen in der Interphase auftritt: Eine Subpopulation war mit den kortikalen Mikrotubuli verbunden, was bereits bei anderen Klasse-XIV-Kinesinen beobachtet wurde, die andere Population wurde im Zellkern lokalisiert. Die Verteilung des Proteins auf den Zellkern konnte durch Kältestress oder durch Hemmung des Kernexports durch den Hemmstoff Leptomycin B (200 nM) spezifisch stimuliert werden. Diese Anhäufung von OsDLK im Kern war reversibel. Da dieses Kinesin in der Lage war, sich zwischen zwei Orten in einer bestimmten Weise hin- und herzubewegen, nannten wir dieses besondere Kinesin OsDLK, was für Dual Localisation Kinesin steht.

The plant cytoskeleton is comprised of two different types of protein polymers: actin filaments and microtubules. They contribute to the cell innate directionality (cell axis, cell polarity) of plant cells that guide morphogenesis up to the organismic level. Motors are a kind of proteins which can bind to the cytoskeleton and use the energy from ATP hydrolysis to move and transport cargoes along the cytoskeleton with certain directionality. While myosins are actin-filaments based motors, kinesins and dyneins move along microtubules. Conventional kinesins have plus-end directionality and dyneins move towards the minus ends. ... mehrHowever, one of the most striking peculiarities of plant directionality is the absence of microtubule minus end-directed cytoplasmic dynein motors in most Gymnosperms, and in all Angiosperms. In contrast, a specific class of minus end-directed kinesins, generally referred to as class-XIV kinesins, have been expanded the most in land plants. Some people believe that some of the functions of dyneins have been taken over by Kinesin-14 members.
In this study, the subcellular function of a class-XIV kinesin referred as OsDLK was addressed. Nevertheless, the heterozygous mutants of rice showed delay in coleoptile elongation in comparison with the wild type seedlings. The homozygous mutants were not able to gain during several generations. Later, dlk showed a relatively high transcripts level during the first 4 days of seeds germination, indicating an important role of OsDLK during early stage of rice seedling development.
In order to get insight of the subcellular role, OsDLK fused with fluorescent reporter was overexpressed in tobacco BY-2 cells (Nicotiana tabacum). We showed by in-vitro sliding that it has the ability to bind to microtubules and move towards its minus-end.
The overexpression of this GFP fusion protein stimulated proliferation and delayed the transition into cell expansion. By synchronising the cell cycle, we could show that the progression into metaphase was delayed in the overexpressor cells while the later phases were clearly accelerated.
Following its localisation during the cell cycle, fusion protein was observed to be repartitioned, colocalising with the wall associated arrays of microtubules (cortical microtubules, phragmoplast). Surprisingly, this protein was found to occur in two populations in interphase - one subpopulation was associated with cortical microtubules as observed in other class-XIV kinesins, the other population was localised in the nucleus. The partitioning of the protein to the nucleus could be specifically stimulated by cold stress, or by inhibiting nuclear export by the inhibitor Leptomycin B (200 nM). This nuclear accumulation was reversible. Since this kinesin was able to shuttle between two locations in a specific manner, we named this particular kinesin OsDLK for Dual Localisation Kinesin.