Erzeugung funktionaler Lipidkapseln aus Nanoemulsionen – Verfahrensentwicklung, Produktcharakterisierung und Erprobung

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Erzeugung funktionaler Lipidkapseln aus Nanoemulsionen sowie der Verfahrensentwicklung und Charakterisierung einzelner Prozesse und Zwischenprodukte. Insbesondere geht diese Ausarbeitung auf Grenzflächenphänomene in kolloidalen Systemen ein, die für pharmazeutische Anwendungen relevant sind. Fernerhin ist die Erprobung von Wirkstoffen auf zellulärer Ebene ein weiterer Bestandteil der vorliegenden Arbeit.
Die zentrifugale Herstellung von Liposomen aus Nanoemulsionen nach Pautot et.al. [1, 2] zeigt, dass der Transport von wässrig dispergierter Phase aus der Ölphase in eine unterliegende Wasserphase prinzipiell möglich ist. ... mehrDer Nachweis erfolgt durch die Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Emulgators sowie der Untersuchung der beteiligten Phasen mittels dynamischer Lichtstreuung. Weiterhin zeigen die Ergebnisse, dass Phospholipide, welche im Öl gelöst sind, nach der Zentrifugation nur zu maximal 5% in dieser ursprünglich gelösten Phase verbleiben. Daraus und aus den Informationen der Analyse der wässrigen Phase nach der Zentrifugation kann abgeleitet werden, dass sich die Phospholipide zu mindestens 50% an dem Aufbau der Grenzfläche zwischen Wasser und Öl, zur Stabilisierung der Emulsionströpfchen, beteiligen.
Die Ergebnisse der Charakterisierung der gebildeten Partikel, welche nach der Zentrifugation in der Wasserphase zu finden sind, weisen darauf hin, dass das Verfahren in seiner technologisch realisierten Form, basierend auf dem Prozess von Pautot et.al. [1, 2], nicht zu den gewünschten Einkapselungseffizienzen führt. Es ergaben sich präzisierte Aufgabenstellungen sowie offene Fragen zur exakten Bildung von Phospholipid-Mono- bzw. Doppelschichten, welche hinsichtlich der Stabilität der Grenzflächen maßgeblich sind. Der Transport der Wasser-in-Öl Emulsionen in die unterliegende Wasserphase führt vermutlich zu einer Deformation der Emulsionströpfchen, bevor diese an der Phasengrenze von einer zweiten Phospholipidschicht ummantelt werden, was in einer ungewollten Freisetzung von Wirkstoff resultiert. Dies äußert sich in Partikeln oder Liposomen, die im Durchschnitt etwa die Hälfte der Partikelgröße der zuvor erzeugten Emulsionen aufweisen sowie in Einkapselungseffizienzen von etwa 25%. Um ein besseres Verständnis über das Adsorptionsverhalten der Emulgatormoleküle, den Phospholipiden, zu erreichen, liegt der Fokus dieser Arbeit auf tensiometrischen Untersuchungen an der Wasser/Öl-Grenzfläche. Diese Analysen liefern einen Einblick in die Flächendichte der Moleküle an der Phasengrenze, was zur Optimierung und späteren Realisierung stabiler Lipidschichten im Zentrifugationsprozess ohne zu hohen Wirkstoffverlust, von Bedeutung ist.
Die Charakterisierung der Struktur und des Aufbaus von Schichten adsorbierter Phospholipidmoleküle, an der Grenzfläche zwischen Wasser und einer zweiten organischen Phase, erfolgt mit Hilfe der Tropfen-Profilanalyse Tensiometrie (PAT). Mittels PAT werden Untersuchungen von Phospholipiden unterschiedlicher Sättigung in den verschiedenen pharmazeutisch relevanten Ölphasen Squalen und Squalan durchgeführt, die Rückschlüsse über die Packungsdichte adsorbierter Moleküle zulassen. In Abhängigkeit von der Sättigung der Ölphasen, in denen die Phospholipide gelöst sind, lassen sich darüber hinaus klare Indizien für eine Monoschichtbildung in der ungesättigten Phase Squalen und für eine Multischichtbildung in der gesättigten Phase Squalan ableiten. Dieses Ergebnis erlaubt zudem Rückschlüsse auf die Stabilität von Emulsionen, was jedoch in dieser Arbeit nicht Gegenstand weiterer Untersuchungen ist.
Die systematische Variation der Tropfenphase und der umgebenden Phase bei der tensiometrischen Analyse ergibt zudem signifikante Unterschiede, die in vergleichender Form noch nicht in der Literatur beschrieben sind. Um deren Ursache aufzuklären und um verifizierte tensiometrische Messergebnisse zu erhalten, kommt zusätzlich Chloroform mit dem Phospholipid DPPC als Referenz zum Einsatz, das als gut beschriebenes Stoffsystem gilt. Durch diese ergänzenden Betrachtungen, auch mit Hilfe weiterer Messmethoden wie der dynamischen Lichtstreuung, Kernspinresonanzspektroskopie und Phosphatanalytik, ist die Ursache für diese Messunterschiede näher beschreibbar. Es wurde eine Abreicherung von Phospholipiden aus der Ölphase in die Wasserphase beobachtet, die stärkere Auswirkungen auf die Phospholipidkonzentration aufweist, wenn das lipidhaltige Reservoir die um den Faktor 100 kleinere Volumenphase darstellt. Dies ist in dem in der Literatur ausschließlich verwendeten Messaufbau, eines Phospholipid-haltigen Öltropfens in 100-fach größeren umgebenden Wasserphasenvolumen, der Fall. Aus diesem Grund kann mit dem invertierten tensiometrischen Messaufbau eines Wassertropfens in Öl eine Empfehlung gegeben werden, der diese Artefakte ausschließt bzw. minimiert.
Die systematische Analyse an der Grenzfläche zweier kaum mischbarer Phasen vermittelt ein umfangreiches Verständnis über das Löslichkeits- und Adsorptionsverhalten von Phospholipiden in den verwendeten pharmazeutischen Ölen Squalen und Squalan. Eine erhöhte Löslichkeit ungesättigter Phospholipide gegenüber gesättigten Phospholipide im ungesättigten Öl lässt sich auf mögliche Lösemittel-Phospholipid-Interaktionen, an den jeweiligen Doppelbindungen der beiden Moleküle (π-π-Interaktionen), zurückführen.
Des Weiteren wird die Anwesenheit oxidativer Verunreinigungen von Squalen genauer untersucht, ein mehrstufiges Aufreinigungsverfahren etabliert und die Auswirkungen dieser Verunreinigungen in Form einer erhöhten Löslichkeit gesättigter Phospholipide beschrieben. Die beobachtete Löslichkeitserhöhung wird im Zusammenhang mit physiologischen Emulsionen, den sogenannten Lipoproteinen, und deren Beteiligung an pathologischen Vorstufen der Entstehung von Arteriosklerose diskutiert. Dies geschieht ebenfalls unter dem Aspekt möglicher Interaktionen zwischen dem Phospholipid und der Ölphase sowie deren Einfluss auf die Stabilität von Lipoproteinen im menschlichen Körper und deren medizinischer Relevanz.
Informationen zur Zytotoxizität unterschiedlicher Wirkstoffe sowie zur Sensitivität verschiedener Tumorentitäten sind für die Durchführung von in vivo-Versuchen von essentiellem Interesse. Daher wird unverkapselter Wirkstoff, pharmazeutisch zugelassener Präparate aus Viscum album (der weißbeerigen Mistel), zur Erprobung auf Tumorzellen verwendet. Dies sind Pflanzenextrakte, die abhängig von der verwendeten Wirtspflanze, auf denen die Mistel wächst, Unterschiede in ihrer Viscotoxin (VT)- und Mistellektin (ML)-Zusammensetzung aufweisen. abnobaVISCUM® (aV) Fraxini, Quercus und Pini, welche in ihrer ML-Konzentration sowie ML-Isoform stark variieren, wurden in vitro auf murinen Zelllinien untersucht.
Die Durchführung von Zellproliferationstests dient zur Bestimmung der mittleren inhibitorischen Konzentration der aV Präparate und zur Auswahl möglichst sensitiver Zelllinien für in vivo-Experimente. aV Pini, das den niedrigsten ML-Gehalt, jedoch überwiegend die ML-Isoform III aufweist, zeigt eine deutlich stärkere Inhibierung der Zellproliferation der Melanomzellen B16-F10 und der Makrophagen RAW264.7 als im Vergleich zu den ML-reicheren Präparaten aV Fraxini und Quercus. Zusätzlich wird die Wirkung von extrahiertem ML I, welches aus Rohmaterial von der Esche gewonnen wurde, in einer vergleichenden in vitro Studie untersucht. Obwohl das getestete ML I für alle untersuchten Zelllinien zytotoxischen ist, sind in Abhängigkeit vom Zelltyp deutliche Unterschiede beobachtbar. Die murinen Dickdarmkarzinomzellen der Zelllinie C26 zeigen dabei die höchste Empfindlichkeit auf das isolierte ML I und sind daher für nachfolgende in vivo Versuche zu empfehlen.

The aim of this work is to generate functional lipid capsules, so called liposomes, by centrifugation of nanoemulsions, to perform a process development and product characterization of the different process steps and intermediates. In particular, this thesis focuses on interfacial phenomena in colloidal systems, which are relevant for pharmaceutical applications. The investigation of the impact of active pharmaceutical ingredients on a cellular level is an additional objective.
The centrifugal manufacturing process of liposomes from phospholipid-stabilized nanoemulsions as intermediates, is shown to be feasible. ... mehrPautot et.al. [1, 2] introduced the concept of the sedimentation of an aqueous dispersed phase from an oil phase into a water phase. The process is investigated and proven by the use of fluorescently labelled phospholipids and their detection in the aqueous phase, as well as by the analysis of both liquid phases via dynamic light scattering. Furthermore, it is shown that phospholipids, which were dissolved in the continuous oil phase of the emulsion, are eliminated from the oil phase during centrifugation. The lipids are being adsorbed at the aqueous phase, while maximally 5% remain in the original dissolved state in the organic phase. From these results and the investigation of the aqueous phase after centrifugation it could be concluded, that phospholipids are at least 50% part of an interfacial structure between water and oil in order to stabilize the emulsion droplets.
However, based on the characterization of particles in the water phase after the centrifugation step, it could be concluded that the use of the technical process conditions, described by Pautot et al. [1, 2], did not allow to reach the desired encapsulation efficiencies so far. Instead, these results revealed essential tasks and open questions in order to understand the exact formation of phospholipid mono- and bilayers during emulsification and centrifugation. During the transfer of water-in-oil emulsions into the water phase, the droplets are probably deformed, before they are covered by the second phospholipid layer at the phase boundary between both liquid phases. This is reflected by the formation of solid lipid particles or liposomes, the latter being about half of the emulsion droplet sizes, as well as by encapsulation efficiencies of about 25%. In consequence, an urgent need for analytical measurements became obvious to improve the understanding for adsorption phenomena of phospholipids as emulsifier. These investigations provide insights into the surface density of the amphiphilic molecules and contribute to an optimized formation of stable lipid layers, especially to avoid high losses of active material in the centrifugal method.
The characterization of the structure and adsorption behavior of phospholipids at the water/oil interface is done by using drop profile analysis tensiometry (PAT). Phospholipids with different saturated hydrocarbon chains, dissolved in the two pharmaceutical oils squalene or squalane, are studied leading to the packing density of adsorbed amphiphilic molecules at the interface. Depending on the oil phase´s saturation, there are clear indications for monolayer formation in the unsaturated phase squalene and for multilayer formation in the saturated phase squalane. In consequence, the result of multilayer formation in squalane is concluded to be an advantage for the stability of nanoemulsions, which was however not further considered or systematically investigated in this work.
By varying the setup of the droplet phase and the surrounding phase during PAT, different results of the adsorption of phospholipids are found, which have not been described in a comparative form in the literature so far. In order to elucidate the reason of these effects, as well as to determine valid data for tensiometric studies, the well-known characterized system of chloroform with the phospholipid DPPC is analyzed as reference. Using complementary measurement techniques such as dynamic light scattering, nuclear magnetic resonance spectroscopy and phosphorus detection, the cause for these measurement differences could be identified. A depletion of phospholipids from the oil phase into the water phase was observed. This depletion had a large effect on the phospholipid concentration of an oil droplet, which has a 100-times smaller volume than the surrounding water phase, as it is the case with the conventional measurement setup. For that reason, an inverted measurement setup, with a water drop in the larger phospholipid oil reservoir, is recommended, which excludes or at least minimizes measurement artifacts. The intensive and systematic analysis of the interface of two immiscible or partly miscible liquid phases leads to a comprehensive understanding of the solubility and adsorption behavior of phospholipids in the pharmaceutical oils squalene and squalane. Moreover, an increased solubility of unsaturated phospholipids compared to saturated phospholipids is found in unsaturated oil, which is explained by attractive solvent-solute interactions. These interactions take place at the respective double bonds (π- π interactions) of both an organic lipid phase and the unsaturated phospholipid.
Furthermore, the presence of impurities in form of oxidation products in unsaturated oil are studied analytically, showing an increased solubility of saturated phospholipids. An adequate purification procedure is introduced in order to remove and to avoid these oxidative impurities. The observation of increased solubility of saturated phospholipids is taken into consideration for the discussion about the pathological appearance of arteriosclerosis under the aspect of possible interactions between phospholipid and oil phase. The influence of these possible interactions from a physiological point of view as well as its medical relevance is discussed for the stability of lipoproteins in the human body.
For the entire development of in vivo pre-clinical studies, the investigation of non-encapsulated drug on tumor cells is of essential interest in order to estimate the cytotoxicity of various active ingredients and to determine the sensitivity of different tumor cell lines. Therefore abnobaVISCUM® (aV) preparations Fraxini, Quercus and Pini are studied in vitro on murine cell lines. These approved preparations of Viscum album are plant extracts, which strongly differ in their viscotoxin (VT) and mistletoe lectin (ML) composition, depending on the host tree of the harvested plant material.
Proliferation assays are performed to elucidate the inhibitory concentrations and select sensitive cell lines for further in vivo experiments. Here, aV Pini preparations, with the lowest ML content and predominantly ML III composition, show a stronger inhibition of proliferation compared to aV Fraxini and Quercus on both B16-F10 and RAW264.7 cells. Moreover, the effect of mistletoe lectin I, extracted from mistletoe, which was harvested from the ash tree, is investigated in a comparative study on murine cell lines in culture. Although mistletoe lectin I is cytotoxic for all tested cell lines, the sensitivity is dependent on the cell type. The murine colon carcinoma cell line C26 proved to be the most sensitive of all tested cell lines and is therefore identified as a good candidate for further in vivo studies.