Abstract:
Monoklonale Antikörper (mAks) haben im vergangenen Jahrzehnt die Landschaft der biopharmazeutischen Industrie dominiert und werden diese Vormachtstellung vermutlich auch noch einige Zeit behaupten. Dies liegt an der Vielseitigkeit ihrer Einsatzmöglichkeiten, z.B. in der Krebstherapie. Typischerweise werden mAks in Säugerzellen, z.B. Chinese hamster ovary (CHO) Zellen, hergestellt. In der Folge haben sich biopharmazeutische Unternehmen auf dieses Expressionssystem fokussiert um das mittlerweile eine ganze Industrie entstanden ist. Trotzdem ist in den letzten Jahren festzustellen, dass das Interesse an Biopharmazeutika, die in Pflanzen produziert wurden, steigt. ... mehrDer Grund dafür ist die wachsende Anzahl und Diversität von biopharmazeutischen Proteinen bei denen es sich neben mAks auch um proteinbasierte Toxine (z.B. Visumin aus der Mistel (Viscum album)) oder Enzyme wie Glycocerebrosidase handelt. Diese Substanzen können u.a. in der Krebstherapie oder zur Behandlung von Stoffwechselerkrankungen wie Morbus Gaucher eingesetzt werden. Im Mai 2012 erhielt eine in Karottenzellen von Protalix Biotherapeutics hergestellte Glycocerebrosidase als erstes Biopharmakum aus Pflanzen die Zulassung für die Anwendung im Menschen durch die FDA und konkurriert seither das erfolgreich mit dem in Säugerzellen produzierten Gegenstück. Zusammen mit der Veröffentlichung der ersten Richtlinien für die Herstellung von Biopharmazeutika in Pflanzen durch die regulatorischen Behörden der USA und der EU ist es wahrscheinlich, dass eine steigende Anzahl pflanzlich hergestellter Proteine in klinischen Phasen getestet und letztlich auch in den Markt eintreten werden. Entsprechend ist mit einem Bedarf an Produktionskapazitäten für diese Proteine zu rechnen, die aktuell jedoch vor allem nur in den USA vorhanden sind. Seit 2009 ist das Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie IME die einzige Einrichtung in der EU, die eine behördliche Genehmigung für die pflanzliche Herstellung von rekombinanten Proteinen für klinische Studien besitzt. Mehr als sieben Chargen des gegen HIV gerichteten mAks 2G12 wurden bereits erfolgreich hergestellt.
Generell können Proteine auf zwei verschiedene Arten in Pflanzen hergestellt werden. Transiente Expression beruht auf dem Transfer der für das Produkt kodierenden DNA Sequenz in die Pflanzenzellen durch Viren oder im Prozessmaßstab häufiger verwendet durch Infiltration mit Agrobacterium tumefaciens. Diese Methode ermöglicht die Herstellung von Proteinen innerhalb von zwei Wochen nachdem ihre DNA-Sequenz bekannt ist. Außerdem sind die Produkttiter bei dieser Methode oft höher als bei transgenen Pflanzen. Letztere haben allerdings die Vorteile, dass ihr genetischer Status klar definiert ist und sogenannte Master und Working Seed Banks ähnlich den Master Cell Banks bei Zellkulturen erstellt werden können. Außerdem zeigen transgene Pflanzen sehr reproduzierbare Produktausbeuten, was günstig für die Beurteilung des Prozesses durch die Behörden sein kann, da diese Konsistenz zwischen Produktionschargen als Qualitätskriterium der Herstellungsprozesse auffassen. Weiterhin sind Prozesse die auf transgenen Pflanzen basieren einfacher zu skalieren, da im Gegensatz zur transienten Expression nicht jede Pflanze einer speziellen Behandlung unterzogen werden muss, durch die eine Produktbildung initiiert wird, sondern die Pflanzen per se das Produkt herstellen können. Entsprechend sind transgene Pflanzen gut für die Herstellung von biopharmazeutischen Proteinen im Großmaßstab geeignet. Vor allem Tabak (Nicotiana tabacum) hat sich zu einer Standardproduktionsplattform entwickelt, wobei die Zielproteine typischerweise aus der Blattmasse extrahiert werden. Bei dem resultierenden Rohextrakt (Figure I-1) handelt es sich um ein problematisches Prozessintermediat, da er nicht nur eine große Anzahl von Partikeln im Mikro- und Millimeterbereich enthält, sondern auch eine hohe Konzentration pflanzlicher Metabolite und Proteine aufweist. Während die Partikel die Kapazität von zur Klärung eingesetzten Filtern herabsetzen, können Metabolite und vor allem pflanzliche Proteine einen negativen Einfluss auf nachfolgende chromatographische Reinigungsschritte oder das Produkt haben, z.B. durch proteolytische Aktivität. Als Folge können bei pflanzenbasierten Prozessen die Produktreinigungskosten mehr als 80% der gesamten Prozesskosten ausmachen. Diese hohen Kosten haben zu Diskussionen geführt, ob pflanzlich hergestellte Biopharmazeutika überhaupt wirtschaftlich konkurrenzfähig hergestellt werden können. Daher beschäftigen sich die in dieser Dissertation beschriebenen Arbeiten mit Strategien welche die Kosten der Produktreinigung aus Pflanzen reduzieren und somit die Konkurrenzfähigkeit dieses Expressionssystems verbessern sollen. Auf der einen Seite wurde ein etablierter Filtrationsprozess optimiert, d.h. die Anzahl der Tiefenfiltrationsschritte wurde von drei auf einen reduziert. Dadurch konnten die entsprechenden Verbrauchsmittelkosten um 50% gesenkt werden während sich die Handhabung des Systems und seine Abgeschlossenheit verbesserten. Der letzte Punkt wird vor allem auch für Prozesse die auf transiente Expression zurückgreifen wichtig sein, da dort mit S1-Bakterien gearbeitet werden muss. Außerdem wurden Hitzefällungsmethoden zur Entfernung von pflanzlichen Proteinen aus Rohextrakt standardisiert und für eine Maßstabsvergrößerung vorbereitet (Figure I-2). Auf der anderen Seite wurde ein kombinierter Ansatz aus experimentellen und modellgestützten Untersuchungen verfolgt mit dem eine Datenbank der häufigsten Tabakproteine erstellt wurde welche wiederrum zur wissensbasierten Vorhersage des chromatographischen Trennverhaltens dieser Proteine genutzt wurde. Dieser Ansatz wird in Zukunft eine vereinfachte und beschleunigte Prozessentwicklung für die Reinigung von biopharmazeutischen Proteinen aus Tabakextrakt ermöglichen, was wiederrum die Wettbewerbsfähigkeit dieses Expressionssystems verbessern wird. Die erzeugten Modelle können darüber hinaus auch mit solchen der Proteinexpression kombiniert werden, wie sie für Tabak bereits etabliert wurden und so zu einer ganzheitlichen Prozessbeschreibung im Sinne eines QbD Ansatzes dienen (Figure I-3).
Abstract (englisch):
Monoclonal antibodies (mAbs) have dominated the biopharmaceutical landscape for the last decade and are likely to maintain their prevalence due to the versatility of their use, e.g. in cancer therapy. Such mAbs are typically produced in mammalian cell cultures, most often Chinese hamster ovary (CHO) cells. This has caused biopharmaceutical companies to focus on this expression system around which an entire industry has emerged. However, interest in plant derived biopharmaceuticals has increased over the last years, with an increasing diversity in active pharmaceutical ingredients (API) being one of the major drivers for this development. ... mehrApart from mAbs, such APIs can include protein-based toxins, e.g. viscumin originally found in mistletoe (Viscum album), or enzymes like glucocerebrosidase, which can be used to treat different types of cancer or Gaucher´s disease respectively. Additionally, subunit vaccines directed against diseases like Malaria or HPV are now being developed in different plant-based expression systems. In May 2012, recombinant glucocerebrosidase produced in carrot cell culture by Protalix Biotherapeutics has received the full regulatory approval as the first plant-derived biopharmaceutical protein and since then successfully competed with the mammalian cell culture-derived counter part of the API. In concert with the regulatory guidelines that have been drafted by the according authorities in the US and EU for the production of biopharmaceutical proteins in plants, this development is likely to fuel the pipeline with plant-derived APIs to be tested in clinical phase trials ultimately entering the biopharmaceutical market. Therefore, production capacity is required to manufacture the corresponding plant-derived proteins in the milligram to gram quantities necessary for clinical phase trials. Currently, these capacities are mostly located in the US with only one site in the EU, i.e. the Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME in Aachen, being operational and a second site being currently commissioned in the UK. Since 2009 the Fraunhofer IME has the permission to produce recombinant proteins in plants for clinical phase trials and has already manufactured more than 12 batches (seven under GMP conditions) of clinical-grade mAbs such as 2G12, a mAb with the potential to block the transmission of Human immunodeficiency virus (HIV).
Protein expression in plants can be achieve via two major techniques. Transient expression relies on the transfer of the DNA sequence encoding the gene of interest into the plant cell which is typically achieved by viruses or more frequently in a scalable process by infiltration with recombinant Agrobacterium tumefaciens. This method facilitates rapid protein production within less than two weeks after obtaining the DNA sequence of the protein of interest. Additionally, protein expression levels are often higher compared to the other method, transgenic plants. However, transgenic plants offer the advantage of a more defined genetic status and the creation of master and working seed banks which is similar to well-known cell culture and microorganism-based approaches where master cell banks are established. Furthermore, the expression levels are highly reproducible which can be beneficial for regulatory approval where inter-batch consistency can be regarded as a quality attribute of the manufacturing process. Additionally, processes using transgenic plants are simpler compared to transient expression because the target protein is per se expressed by the plants, whereas transient expression requires that each plant of every batch is treated with the bacteria to induce target protein synthesis, which is associated with an increased handling effort and process complexity as well as additional labor and costs. Therefore, transgenic plants are the more suitable method for large scale production of biopharmaceutical proteins such as mAbs. Nicotiana tabacum (tobacco) has emerged as a standard production platform due to its short life cycle and high biomass output with target proteins being typically extracted from the leaves by blade-based homogenizers (Figure I-1).
The resulting raw extract is a challenging process intermediate because it contains a large number of micro- to millimeter particles, a high concentration of plant metabolites and host cell proteins. The former can induce premature blocking of the filters used to clarify the extract before chromatographic purification, which can substantially increase the consumables costs for the according filters, whereas the latter two can interfere with this purification or even cause product degradation, e.g. due to protease activity. As a consequence, more than 80% of the total production costs for plant-derived biopharmaceutical can be associated with downstream processing. These potentially excessive costs have raised questions about the economic viability of plant-based biopharmaceuticals in general. The work in this thesis has therefore focused on strategies aiming to reduce downstream processing costs and thus contribute to the competitiveness of plants as a production platform for biopharmaceutical proteins. Therefore, an established but costly filtration train was optimized by reducing the number of depth filtration steps from three to one, thereby reducing the consumables costs by more than 50% and simultaneously cutting operator handling and improving process containment. This simplification of the process was achieved by a three stage approach consisting of i) screening for more efficient filters, ii) testing of flocculants to promote aggregation of dispersed particles and thus facilitate their separation from the liquid process stream and iii) the use of filters aids to delay the clogging of depth filters. For the latter two stages a statistical experimental approach (design of experiments) was selected in order to obtain predictive models for the flocculation and filter coating processes, which are currently too complex to be simulated by mechanistic models. The initial filter capacity of ~25 L m-2 was increased to more than 1000 L m-2 when flocculants and filter aids were used in combination. Polyethylene imine (Polymine P) was found to be the most effective flocculant and was best complemented with the cellulose-based filter aid LuvoZell C200. The effectiveness of the flocculants was confirmed in a 100-L pilot scale process. In total, these improvements have the potential to reduce the filtration associated costs by more than 75%.
In the context of filtration, a novel design for a single-use bag filter was developed which can replace current multi-use stainless-steel solutions. This will be a major improvement for upcoming processes using Agrobacterium-mediated transient expression, which will require cautious handling of plant extracts due to the safety class 1 (or higher) rating of the bacteria. The new bag filter will not only increase the process containment, i.e. prevent bacteria from contaminating surfaces of the production equipment, e.g. during cleaning, but will render cleaning and cleaning validation obsolete for this process step, reducing costs for labor, validation and monitoring accordingly.
Additionally, previously reported heat treatment methods (Figure I-2) that reduce the host cell protein concentration in tobacco extracts before purification have been standardized for easy scalability. For this purpose heat treatment by blanching (submersion of intact leaves into a hot buffer), a heat exchanger and a heated vessel (Figure 2) were compared in terms of host cell protein removal, product recovery and effect on filter capacity. Blanching at 65°C was found to be most effective in this respect and compatible with existing purification processes whereas all methods were able to remove more than 90% of the host cell proteins. This has the potential to significantly reduce the overall purification effort, e.g. reduce the number of chromatographic purification steps, and to increase the product stability due to the inactivation of host proteases. Of course, this method is only applicable to products that can withstand temperatures around 65°C without relevant conformational changes or even denaturation.
The second part of this thesis describes a combined experimental and modeling approach which was chosen (i) to establish a dataset of host cell proteins present in aqueous tobacco extracts, and (ii) to use these data for the knowledge-based design of chromatographic purification strategies for various target proteins. In a first step, a decision tree for protein purification from clarified tobacco extract was developed based on an empirical approach characterizing the separation profiles of various host cell proteins on different chromatography resins and under several conditions typically used during downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. The decision tree can be used as a simple guide to process design heuristics. In a second step, a model based-approach was pursued and the three-dimensional structures of about 100 of the most abundant host cell proteins from tobacco were modelled. These models were combined with data from chromatographic separations of model proteins to build quantitative structure activity relationship models for the retention of these host cell proteins on defined chromatography resins. With an increasing size of model data, the accuracy for the predicted separation of host cell proteins increased and was best for SP Sepharose. This approach will facilitate and accelerate process development for new target proteins produced in tobacco as promising purification conditions can be identified more rapidly (Figure I-3), thereby reducing costs and again contributing to the competitiveness of plant-based production platforms. The models generated for the different clarification and chromatography techniques can also be combined with the models for protein expression that have been previously developed to extend the QbD approach for the whole process.
