Combination of plant metabolic modules yields synthetic synergies

Das große Potenzial pharmakologisch wirksamer pflanzlicher Sekundärmetabolite ist oft durch eine geringe Ausbeute und Verfügbarkeit der produzierenden Pflanzen begrenzt. Die chemische Synthese dieser komplexen Verbindungen ist oftmals zu teuer. Die Pflanzenzellfermentation bietet eine alternative Strategie zur Überwindung dieser Einschränkungen. Die Produktion in Batch-Zellkulturen bleibt jedoch oft ineffizient. Ein Grund könnte die Tatsache sein, dass verschiedene Zelltypen für die Produktion der Metabolite interagieren müssen, was in Suspensionszellkulturen nur schlecht nachgebildet werden kann. ... mehrDie Sekretion des Endprodukts in das Kulturmedium stellt ein weiterer limitierender Faktor dar, wenn das Aufschließen der Zellen für die Produktgewinnung vermieden werden soll. Am Beispiel des Alkaloidstoffwechsels von Tabak untersucht diese Arbeit eine alternative Strategie, bei der die Wechselwirkungen im Stoffwechsel verschiedener Zelltypen eines Pflanzengewebes mittels verschiedener pflanzenzelltypischer Stoffwechselmodule technisch nachgebildet werden. Diese Studie bildet die Wechselwirkung zwischen den Nicotin-sekretierenden Zellen der Wurzel und den Nicotin-konvertierenden Zellen des seneszenten Blattes nach, wobei die Zielverbindung Nornicotin in der Modellzelllinie Tabak BY-2 erzeugt wird. Wenn die Nikotin-Demethylase NtomCYP82E4 in BY-2 Tabakzellen überexprimiert wurde, wurde die Nornicotinsynthese ausgelöst. Die Nornicotinsynthese erfolgte allerdings nur in einem geringen Ausmaß. Es wird jedoch in dieser Arbeit gezeigt, dass die Produktion von Nornicotin in dieser Zelllinie durch Zuführen des Vorläufers Nicotin verbessert werden konnte. Das Metabolic Engineering einer anderen Zelllinie, die das Schlüsselenzym NtabMPO1 überexprimiert, erlaubte es, die Bildung und Sekretion dieses Vorläufers anzuregen. Diese Studie zeigt ferner, dass die Nornicotinakkumulation der NtomCYP82E4-Zellen ohne irgendeinen negativen Effekt auf die Physiologie der Zellen signifikant stimuliert werden konnte, indem konditioniertes Medium der NtabMPO1-Überexpressionslinie zugeführt wurde. Die Cokultivierung der NtomCYP82E4 mit den NtabMPO-Zellen regte die Nornicotinakkumulation sogar noch weiter an und zeigte, dass die physikalische Gegenwart von Zellen besser war, als nur das konditionierte Medium zuzuführen, das aus den gleichen Zellen gewonnen wurde. Diese Ergebnisse liefern einen Beweis für das Konzept, dass in der Pflanzenzellfermentation die Kombination verschiedener metabolischer Module die Produktivität von Zielverbindungen verbessern kann. Für eine effiziente Downstream-Rückgewinnung der Produkte wurde eine Strategie getestet, die sich nanosecond Pulsed Electrical Fields (nsPEFs) zunutze macht. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die weitere Verwendung der Biomasse zu ermöglichen, wurden die Zellen starken (1-20 kV cm-1), aber sehr kurzen (10-100 ns) elektrischen Impulsen ausgesetzt, was zu einer vorübergehenden Permeabilisierung der Zellmembranen führte.

The great potential of pharmacologically active secondary plant metabolites is often limited by low yield and availability of the producing plant. Chemical synthesis of these complex compounds is often too expensive. Plant cell fermentation offers an alternative strategy to overcome these limitations. However, production in batch cell cultures remains often inefficient. One reason might be the fact that different cell types have to interact for metabolite maturation, which is poorly mimicked in suspension cell lines. Secretion of the final product to the culture medium to avoid cell rupture for product recovery is another limiting factor. ... mehrUsing alkaloid metabolism of tobacco, this work explores an alternative strategy, where the metabolic interactions of different cell types in a plant tissue are technically mimicked based on different plant-cell based metabolic modules. This study simulates the interaction found between the nicotine secreting cells of the root and the nicotine-converting cells of the senescent leaf, generating the target compound nornicotine in the model cell line tobacco BY-2. When the nicotine demethylase NtomCYP82E4 was overexpressed in tobacco BY-2 cells, nornicotine synthesis was triggered, but only to a minor extent. However, it is shown here that the production of nornicotine in this cell line could be improved by feeding the precursor, nicotine. Engineering of another cell line overexpressing the key enzyme NtabMPO1 allows to stimulate accumulation and secretion of this precursor. This study shows that the nornicotine production of NtomCYP82E4 cells can be significantly stimulated by feeding conditioned medium from NtabMPO1 overexpressors without any negative effect on the physiology of the cells. Co-cultivation of NtomCYP82E4 with NtabMPO1 stimulated nornicotine accumulation even further, demonstrating that the physical presence of cells was superior to just feeding the conditioned medium collected from the same cells. These results provide a proof of concept that combination of different metabolic modules can improve the productivity for target compounds in plant cell fermentation. For efficient downstream recovery of the products, a nanosecond pulsed electric fields (nsPEFs) strategy was tested. To maintain cell viability and allow for the further use of biomass, cells were exposed to strong (1-20 kV cm-1), but very short (10-100 ns) electric pulses which leads to a temporary permeabilization of cell membranes.