Synthese von Peptiden, Peptoiden und Protein-ähnlichen Strukturen im µ Arrayformat

Für das Verständnis von biologischen Prozessen ist die Erforschung von Protein Protein Wechselwirkungen unabdingbar. Diagnostische Marker oder neue Impfstoffe können dadurch zugänglich gemacht werden. Arrays, die unterschiedliche, voneinander räumlich getrennte Peptide oder Proteine tragen, erlauben ein Hochdurchsatz-Screening um Bindungsstellen zu untersuchen, die für biologisch relevante Interaktionen verantwortlich sind. Peptidarrays werden für die Untersuchung linearer und zyklischer Bindungsstellen verwendet. Für konformationelle- oder diskontinuierliche-Bindemotive werden Protein-Arrays benötigt, die bisher nur mittels biologischer Methoden hergestellt werden können. ... mehrAllerdings ist die Herstellung von hochdichten Protein Arrays teuer, die Faltung der biologisch synthetisierten Proteine ist meistens unbekannt, spezifische Epitope verbergen sich gegenseitig und nur eine begrenzte Anzahl verschiedener Proteine ist verfügbar. Daher haben Peptid basierte Arrays, die Protein-ähnliche Strukturen nachahmen können, ein enormes Potenzial.
Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit einer Methode zur Herstellung solcher Strukturen im Array-Format als mögliche Alternative zu Protein-Arrays. Dazu wurden Trifunktionale Linker, als Anker für zwei oder drei verschiedene Peptide, an der festen Phase synthetisiert. Aufgrund der räumlichen Nähe können die Peptide miteinander interagieren und eine Protein ähnliche Struktur bilden. Proteinartige Strukturen wurden erfolgreich an der festen Phase synthetisiert. Durch die Verwendung einer Transfermethode, die eine in situ Aufreinigung der erzeugten Peptidarrays ermöglicht, konnten gereinigte Arrays mit Protein-ähnlichen Strukturen generiert werden. Der Nachweis erfolgte massenspektrometrisch und mittels Immunfärbung.
Im zweiten Teil dieser Arbeit geht es um die Synthese von Peptidarrays mit Sonderbausteinen unter der Verwendung einer Laser-basierten Methode. Mit dieser Methode sind Peptidarrays mit einer Dichte von mehr als 17 000 Peptiden/cm2 möglich. Hierfür werden die benötigten Chemikalien in ein festes Lösungsmittel (Polymermatrix) eingebettet. Diese Mischung wird in einem gewünschten Spotmuster mit Hilfe eines Lasers auf eine Oberfläche (Akzeptor) transferiert. In einem separaten Hitze-Schritt erfolgen dann die Diffusion und die Kupplung der transferierten Chemikalien an die vorhandenen funktionellen Gruppen der Oberfläche. Zahlreiche Sonderbausteine wie posttranslational modifizierte Aminosäuren oder Fluorophore konnten in einen Peptidarray eingebaut werden. Zudem konnten Peptidarrays via Click Chemie erfolgreich mit der Laser-basierten Methode modifiziert werden.
Der dritte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Synthese von hochdichten Peptoidarrays. In Bindungsstudien erwies sich die große Vielfalt der Peptoide als gute Alternative zu Peptiden. Sie können Peptide auf Grund ihrer Strukturähnlichkeit nachahmen, bieten jedoch den Vorteil einer Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau, eine längere in vivo Halbwertszeit, eine bessere Löslichkeit und bessere Membrandurchlässigkeit.
Peptoidarrays mit mehr als 1600 Peptoiden/cm2 können mit Hilfe der Submonomer Methode von Zuckermann und der Monomer-Methode mittels des Laser basierten Verfahren generiert werden und die synthetisierten Peptoide konnten massenspektrometrisch nachgewiesen werden. Zudem konnten Peptoide via ortsaufgelöster Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) nachgewiesen werden. Hierbei wurde die Laser-basierte Methode eingesetzt, um die benötigte MALDI-Matrix zu transferieren.

The investigation of protein-protein interactions plays an important role in understanding biomolecular processes. This allows for the investigation of diagnostic markers and the development of new vaccines. Arrays, which bear different peptides or proteins arranged as separate spots, permit high-throughput screening to investigate binding sites. Peptide arrays are used to study linear and cyclic binding sites, responsible for the interactions. To study the more abundant conformational or discontinuous binding sites, protein arrays are the major choice, where proteins still have to be produced with biological methods. ... mehrHowever, the drawbacks of such arrays are the high costs of generating high density protein arrays, the protein conformations are largely unknown, specific epitopes can conceal each other, and only a limited number of proteins are available. Therefore, peptide based arrays, which can mimic protein-like structures, have an enormous potential.
Therefore, the focus of the first part of this thesis lies on a method to create such structures in the array format as a versatile alternative to protein arrays. A trifunctional linker, which can react with two or three different peptides, was synthesized. Due to the spatial proximity, the peptides interact and can form a protein-like structure. As a proof of concept, protein-like structures were generated on beads and on a polymer synthesis surface. Moreover, a multistep transfer process allows for the synthesis of purified high density arrays.
The second part of this thesis is focused on the synthesis of arrays with special building blocks or the coupling of fluorophores via a Laser-based approach. With this method, peptide arrays with densities of > 17 000 spots/cm2 were built up. The required chemicals embedded in a solid solvent (a polymer matrix) were Laser-transferred to an acceptor surface in a desired pattern. In a separate heating step, the matrix becomes viscous and allows for the diffusion and coupling of the chemicals to the free functional groups on the synthesis surface. Numerous dedicated building blocks, e.g. post-translationally modified amino acids were successfully coupled to an array via the Laser-based approach. Fluorophores were built up or modifications of their side chains via click chemistry were shown.
In the third part, the main focus was on the Laser-based synthesis of high-density peptoid arrays. In binding studies, peptoids have already proven to be versatile binders for proteins. They can mimic peptides, due to their structural similarity. Furthermore, they have the advantages in e.g. resistance to proteolytic cleavage, a better solubility, and cell membrane permeability. Peptoid arrays with > 1600 peptoids/cm2 could be synthesized with the Laser-based approach by following the submonomer method of Zuckermann or the monomer method and the peptoid synthesis could be successfully validated via Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation (MALDI) mass spectrometry.