Die Erysiphe necator Resistenzen Ren3 und Ren9 aus ’Regent’ – Eingrenzung, Analyse von Kandidatengenen und differentielle Genregulation

Durch die hier vorgestellten Arbeiten konnten in zwei unabhängigen experimentellen
Kreuzungspopulationen die beiden beschrieben Resistenzloci Ren3 und Ren9 gegen den
Echten Mehltau der Weinrebe bestätigt werden. Der Resistenzlokus Ren3 konnte in
Parallelarbeiten auf ein 200 kb Intervall eingegrenzt werden und es konnte eine HR als
Resistenz-Mechanismus gezeigt werden. In den beiden Kreuzungspopulationen ’Regent’ x
’Cabernet Sauvignon’ und GF.GA-47-42 x ’Villard Blanc’ konnten die beiden Resistenzen
durch QTL-Analysen mithilfe von Feldboniturdaten nachgewiesen werden. ... mehrDer zuvor neu
beschriebene Resistenzlokus Ren9 konnte durch genetische und mikroskopische Analysen mit
F1-Individuen aus unterschiedlichen experimentellen Kreuzungspopulationen auf ein Intervall
von rund 300 kb eingegrenzt werden. Dabei wurden die genetischen Marker GF15-08, GF15-
10 und Indel-7 als Resistenz-gekoppelte genetische Bereiche identifiziert. Ebenfalls zeigten
diese Analysen eine HR ausgelöst durch die in Ren9 kodierten Gene, nach Inokulation mit
dem Echten Mehltau. Durch Parallelarbeit zur Eingrenzung des Resistenzlokus Ren3, war
eine Analyse der dort kodierten Gene möglich. Diese Untersuchungen identifizierten ein
Cluster aus vier CC-NBS-LRR Genen in diesem Resistenzlokus. Durch Transkript-Analysen
konnten zwei unterschiedliche Splice-Varianten des Gens Ren3-1 identifiziert werden.
Analysen zur differentiellen Genregulation zeigten, dass die beiden identifizierten R-Gene
Ren3-1 und Ren3-4 nur in ’Regent’ transkribiert werden. Für Ren3-4 konnte hierbei eine
Induktion nach Inokulation mit dem Echten Mehltau festgestellt werden. Diese Induktion
könnte darauf hindeuten, dass Ren3-4 das Resistenz-vermittelnde Gen aus Ren3 ist. Eine
vergleichende Analyse des Resistenzlokus Ren3 aus ’Regent’ mit der Sequenz des
Referenzgenoms PN40024 12Xv0 zeigte eine etwa 110 kb große Insertion im kodierenden
Bereich von Ren3-4. In dieser Insertion wurden mehrere Retrotransposons identifiziert. Im
Promotorbereich von Ren3-1 konnte in PN40024 12Xv0 ein zusätzliches Retrotransposon
identifiziert werden. Die 110 kb Insertion und das zusätzliche Retrotransposon führen
wahrscheinlich dazu, dass die beiden Gene exklusiv in ’Regent’ transkribiert werden. Da
PN40024 einen reinen V. vinifera Hintergrund aufweist und diese Art der Weinrebe sich
getrennt vom Echten Mehltau entwickelt hat, könnte die Insertion der Retrotransposons ein
Hinweis für die Stilllegung von nicht benötigten Resistenzgenen sein. Dies ist ein
wirkungsvoller Mechanismus, welcher möglichen Autoimmunreaktionen vorbeugen kann.
Bei der Analyse der differentiellen Regulation von bekannten Resistenz-vermittelnden Genen
konnten nach Inokulation von ’Regent’ im Vergleich zu der anfälligen Rebsorte
’Chardonnay’ deutliche Unterschiede festgestellt werden. Insbesondere bei der Regulation der
bekannten PR-Gene konnte gezeigt werden, dass die Resistenz-Antwort in ’Regent’ schneller
und andauernder ist. Bei der differentiellen Genregulations-Analyse konnten des weiteren,
mögliche orthologe Gene der HR-Regulation, welche aus A. thaliana bekannt waren, in der
Weinrebe untersucht werden. Eine beobachte differentielle Regulation dieser Gene in
’Regent’ verglichen mit ’Chardonnay’ nach Inokulation mit dem Echten Mehltau, stellt den
ersten Schritt dar, um auf molekularer Ebene die mikroskopisch beobachtete HR
nachzuvollziehen. Es konnten ebenfalls Vorarbeiten für die funktionelle Analyse von Ren3-1
eingeleitet werden durch die Erstellung von amiRNAs zum Knock-down in ’Regent’ und
Transformationen von anfälligen Reben mit Ren3-1.

The work presented here confirms the two recently described resistance loci Ren3 and Ren9,
which confer resistance to grapevine powdery mildew in two independent crosspopulations.
The interval of Ren3 could be delimited to a 200 kb region by parallel work. Further it could
be shown that this locus enables the plant to react with a HR upon powdery mildew infection.
It was possible to reproduce the two described resistance loci by QTL analysis with
phenotypic field data in the two populations ’Regent’ x ’Cabernet Sauvignon’ and GF.GA-47-
42 x ’Villard Blanc’. Also it was shown that a classification into resistant and susceptible
... mehr
genotypes according to observed SSR marker alleles of the resistance-linked genetic markers
was possible. By genotypic and microscopic analysis of specifically selected F1 individuals
with recombination on chromosome 15 from different crosses, the genomic interval of the
resistance locus Ren9 was reduced to around 300 kb. The genetic markers GF15-08, GF15-10
and Indel-7 where identified to be closely linked to the locus conferring resistance to powdery
mildew. Furthermore, HR associated with appressoria after infection with powdery mildew
could be confirmed for Ren9. Parallel works on Ren3 enabled an analysis of genes encoded in
this resistance locus. Hereby a cluster of four CC-NBS-LRR genes was identified. Transcript
analysis of Ren3-1 revealed two different splice variants for this gene. Differential gene
expression experiments after inoculation with powdery mildew showed that the two genes
Ren3-1 and Ren3-4 are exclusively transcribed in the grapevine cultivar ‘Regent’ and that
transcript levels of Ren3-4 are elevated upon infection with powdery mildew. The elevated
transcript levels of Ren3-4 could give a hint that this gene might confer the resistance to
powdery mildew associated with the resistance locus Ren3. A comparison of Ren3 from
‘Regent’ and the reference genome PN40024 12Xv0 revealed major differences. Here an
approximately 110 kb insertion in the coding region of Ren3-4 was identified comprising
several retroelements. Also in the promoter region of Ren3-1 an additional retroelement was
identified in PN40024 12Xv0. These two insertions probably inactivate the resistance genes
in the susceptible PN40024. Their absence explains the exclusive transcription of these two
genes in ‘Regent’. PN40024 has a pure V. vinifera background. This grapevine species
evolved without the presence of powdery mildew. The insertion of the found retroelements
could therefore be a way to silence not needed resistance genes. This silencing mechanism is
thought to help prevent autoimmunity conferred by resistance genes. Analysis of differential
gene expression upon inoculation with powdery mildew revealed major differences between
the resistant cultivar ‘Regent’ and the susceptible cultivar ‘Chardonnay’. Especially by
looking at genes of the pathogenesis-related group it could be shown that the resistance
response in ‘Regent’ is faster and longer lasting. Additionally, it was possible to analyze
possible orthologous genes involved in HR regulation, which were already described in A.
thaliana. The differential experession of these genes in ‘Regent’ compared to ‘Chardonnay’
after inoculation with powdery mildew, could indicate the first steps in characterizing the
observed HR on a molecular level. Furthermore, it was possible to prepare for the functional
analysis of Ren3-1 by generating amiRNA constructs and transforming them into ‘Regent’ for
a knockdown of the gene. In addition, it was possible to transform susceptible genotypes with
the gene Ren3-1.