ω-Transaminases as Promising Biocatalysts for the Chiral Synthesis of β-Amino Acids

Diese Arbeit erörtert die Enzyme-Familie der ω-Transaminasen (ω-TA), die eine stereoselektive Übertragung einer Stickstoffgruppe von einem Amino-Donor auf ein Akzeptor Molekül (mit Keton/Aldehyd-Funktion) katalysieren. ω-Transaminasen sind von großem Interesse für viele pharmazeutische Prozesse und Synthese-Strategien, da selbige es ermöglichen, stickstoffhaltige Wirkstoffe enantiomerenrein zu produzieren.
Die Dissertation, angefertigt im Rahmen des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten Projektes Molecular Interaction Engineering (MIE), beschäftigte sich hierbei mit der Enzymherstellung und Modifikation am Beispiel der Synthese von β-Aminosäuren sowie dem Abbau selbiger durch Mikroorganismen. ... mehrIm Fokus dieser Arbeit stand daher die Transaminierung von β-Ketosäuren/estern, das dafür notwendige Enzym Engineering, sowie die Charakterisierung und Katalogisierung der ω-Transaminase-Familie. Das primäre Ziel war hierbei die Synthese des chiralen Paclitaxel-Bestandteils, β-Phenylalanine(ester), durch ω-Transaminasen demonstrieren.
Zusammenfassend konnten in dieser Thesis folgende Punkte erreicht werden:

o Die Proteinproduktion und Reinigung der ω-TA aus Variovorax paradoxus konnte durch Codon-Optimierung sowie Fast-protein-liquid-chromatography (FPLC) mittels Ni-NTA-Säulen verbessert werden und die Langzeitstabilität konnte erhöht werden.
o Außerdem konnte eine ω-Transaminase-Engineering-Datenbank (oTAED) als hilfreiche Basis für das Transaminase Engineering etabliert werden.
o Funktionelle Aminosäurepositionen in der V. paradoxus ω-TA wurden mutiert und die Auswirkungen auf die Aktivität untersucht.
o Durch gezielte Mutagenese konnte die Proteinstabilität der ω-TA aus V. paradoxus unter gleichzeitigem Erhalt der Aktivität verbessert werden.
o Es konnten die Schwierigkeiten bei der Synthese von β-Phenylalanin (β-PA) durch eine Lipase-ω-TA Kaskadenreaktion erörtert und gezeigt werden. Hierbei wurden alternative Syntheseweg vorgeschlagen und analysiert.
o Es wurden zwei ω-TA für die Synthese von (R)- sowie (S)-β-PA-Ethylester identifiziert durch Screening einer ω-TA Bibliothek.
o Eine ω-TA (namentlich 3FCR_4M) zeigte Potenzial für eine Maßstabsvergrößerung um den Faktor 200 für die Synthese des (S)-β-PA-Ethylester (200 mL - 30 mM Produktkonzentration).
o Der Abbau von β-PA durch zwei Bakterien konnte unter kontrollierten Bedingungen genauer analysiert werden. Dabei wurde erstmals der simultane Abbau beider Enantiomere einer β-Aminosäure durch ein Bakterium gezeigt, wobei neben der Transaminierung noch ein weiterer, bislang unbekannter Abbaumechanismus erfolgt.

The enzyme family of ω-transaminases (ω-TA) catalyzes a stereoselective transfer of an amino group from an amino donor to an acceptor molecule (with ketone/aldehyde function). ω-TA are of great interest for many pharmaceutical processes and synthesis strategies, as they enable the production of enantiomerically pure amino-drugs.
This thesis, which is part of the Molecular Interaction Engineering (MIE) project funded by the German Federal Ministry of Education and Research, deals with enzyme production and modification using the synthesis of β-amino acids and their degradation by microorganisms as examples. ... mehrTherefore, the focus of this work was set on the transamination of β-keto acids/esters, the necessary enzyme engineering, as well as the characterization and cataloguing of the ω-transaminase family. The primary goal was to demonstrate the synthesis of the chiral cancer drug component paclitaxel (Taxol), β-phenylalanine(ester), mediated by ω-transaminases.
In summary, the following points could be achieved in this thesis

o The β-phenylalanine converting Variovorax paradoxus ω-TA gene was codon optimized for expression in E. coli BL21, purified by fast-protein-liquid-chromatography (FPLC) using Ni-NTA columns and thermostabilized by in silico guided site directed mutagenesis.
o The ω-transaminase engineering database (oTAED) was developed as a helpful starting point for protein engineering and discovery of ω-TA.
o Functional amino acid positions in the V. paradoxus ω-TA were mutated and the effects on activity were investigated.
o The protein stability of ω-TA from V. paradoxus was improved by targeted mutagenesis (single mutation) while maintaining the enzymatic activity.
o The difficulties in the synthesis of β-phenylalanine (β-PA) by a lipase-ω-TA reaction cascade were demonstrated. Alternative synthesis methods were proposed and at least one established.
o Therefore two ω-TA for the synthesis of (R)- and (S)-β-phenylalanine ethyl ester were identified by screening an ω-TA library.
o The ω-TA 3FCR_4M showed potential for up-scaling by a factor of 200 for the synthesis of (S)-β-phenylalanine ethyl ester (200 mL - 30 mM product concentration).
o The degradation of β-phenylalanine by two bacteria was analyzed in detail under controlled conditions. Additionally for the first time the simultaneous degradation of both enantiomers was shown for one bacterium.