Identifikation und Charakterisierung von rlcA, einer neuen Komponente des Lichtsignalweges in Aspergillus nidulans

Licht ist eines der wichtigsten Signale, um physiologische und morphologische Prozesse in vielen Organismen zu regulieren. Es hilft dabei, sich an verschiedene Umgebungsbedingungen anzupassen. Der filamentöse Ascomyzet Aspergillus nidulans ist in der Lage sowohl rotes als auch blaues Licht wahrzunehmen. Das pilzliche Phytochrom FphA (fungal phytochrome A) ist der Hauptlichtrezeptor in A. nidulans. Neben FphA gibt es die beiden Blaulichtrezeptoren LreA und LreB sowie das Cryptochrom CryA. Der FphA-abhängige Signalweg ist in A. nidulans gut untersucht jedoch besteht großes Interesse alle Komponenten zu identifizieren. ... mehrZiel dieser Arbeit war es neue Komponenten oder Signalwege finden.
Daher wurde eine UV-Mutagenese mit einem Auxotrophie-Reportersystem durchgeführt. Das Auxotrophiemarker-Gen pyr4 aus Neurospora crassa wurde unter der Kontrolle des lichtregulierten conJ Promotors exprimiert. Es wurden 100 konstitutive Mutanten isoliert, die trotz Abwesenheit des Auxotrophiemarkers im Medium ein verstärktes Wachstum in der Dunkelheit zeigten. Nach dem Rückkreuzen, um Hintergrundmutationen zu reduzieren, wurde das Genom einer Mutante vollständig sequenziert, um die verantwortliche Mutation zu identifizieren. Das Gen AN1777 wies zwei Basensubstitutionen auf, die zu einem vorzeitigen Stop-Codon führten. Es wurde aufgrund seiner Funktion rlcA (regulator of light responsive genes and chromatin remodelling A) genannt. RlcA kodiert für ein Protein, das eine Nterminale PHD-Fingerdomäne, eine TFSIIM-Domäne und eine C-terminale SPOC-Domäne enthält. Von der Literatur ist bekannt, dass PHD-Fingerdomänen am Chromatin-Remodelling beteiligt und SPOC-Domänen an transkriptionellen Repressor-Komplexen beteiligt sind. Der mutierten Version des Proteins von RlcA (RlcA1-381) fehlt diese SPOC-Domäne.
Überexpressionsexperimente führten durch bereits publizierte Ergebnisse zu der Annahme, dass dieses Protein den Acetylierungszustand des lichtregulierten Gens ccgA moduliert. Dies konnte durch ChIP-Experimente bestätigt werden. Die durch Split YFP bestätigte Interaktion von RlcA und FphA führte zu der Vermutung, dass es eine Aktivierung von RlcA durch FphA geben könnte. Weiterhin wurde die Interaktion von RlcA und der Acetyltransferase GcnE, einer Komponente des SAGA-Komplexes, durch Split-YFP bestätigt und die Interaktionsdomäne konnte identifiziert werden. Eine andere Wechselwirkung von RlcA mit SsnF, einem Protein eines Korepressor-Komplexes, konnte nur mit beiden Proteinen voller Länge gezeigt werden. Es gab keine Wechselwirkung der mutierten Version von RlcA und SsnF. In dieser Doktorarbeit konnte so ein neuer regulatorischer Komplex gefunden werden, der an der Regulierung lichtinduzierbarer Gene und der Modifizierung von Chromatin beteiligt ist.
Die Fähigkeit, Licht wahrzunehmen, bietet die Möglichkeit einer besseren Vorbereitung von Stoffwechselprozessen, um sie an den täglichen Rhythmus anzupassen. In N. crassa steuert eine zirkadiane Uhr, die aus einer autoregulatorischen negativen Rückkopplungsschleife besteht, die Expression von Genen auf regulatorische Weise. Bislang war eine solche Uhr in A. nidulans nicht zu finden. Einige Komponenten der inneren Uhr von N. crassa sind in A. nidulans enthalten, die WC-Homologen LreA und LreB, wichtige Komponenten wie FRQ oder VVD sind jedoch nicht zu finden.
Im bd-Stamm von N. crassa, der eine Mutation im ras-1 Gen aufweist, ist eine deutliche circadiane Sporulation zu erkennen. Durch Einbringen dieser Mutation in das rasAGen hätte eine circadiane Sporulation von A. nidulans visualisiert werden sollen. Durch das Einführen von Temperaturzyklen zeigten A. nidulans Stämme, die die Mutation in rasA enthielten, eine Ringbildung. Unter Verwendung eines Luciferase-Reporter-Systems konnte eine zirkadiane Expression der Luciferase unter dem ccgA-Promotor in Temperaturzyklen beobachtet werden. Bei freien Läufen bei konstanter Temperatur und dauerhaftem Licht konnte eine rhythmische Expression von ccgA, conJ und gpdA bei rotem Licht beobachtet werden.

Light is one of the most important signals to regulate physiological and morphological processes in many organisms, it helps to adapt to different environmental conditions. The filamentous ascomycete A. nidulans is able to sense red light as well as blue light. The fungal phytochrome FphA is the main photoreceptor in A. nidulans. Besides FphA it has the two blue light receptors LreA and LreB as well as the Cryptochrome CryA. The FphA dependent signalling pathway is well studied in A. nidulans and we aimed to find new components or signalling pathways.
Therefore, we performed a UV mutagenesis with an auxothrophy reporter system. ... mehrNeurospora crassa auxotrophic marker gene pyr4 was expressed under the control of the light-regulated conJ promoter. We could obtain 100 constitutive mutants which showed an enhanced growth in darkness in absence of the auxotrophic marker in the media. After backcrossing to get rid of background mutations one mutant was sent to sequencing to map the mutation. The gene AN1777 had two single base substitutions which led to a premature stop codon. It was named rlcA (regulator of light responsive genes and chromatin remodeling A) because of its function. RlcA encodes a protein which harbours a N-terminal PHD-finger domain, a TFSIIM domain and a C-terminal SPOC domain. PHD-finger domains are involved in chromatin remodelling and SPOC domains are involved in transcriptional repressor complexes. The premature protein of RlcA lacks the SPOC domain. Overexpression experiments led to the presumption that this protein modulates the acetylation state of the light regulated gene ccgA. This could be confirmed by ChIP experiments. The interaction of RlcA and FphA, which was confirmed by Split YFP, led to the speculation that there might be an activation RlcA by FphA. Further the interaction of RlcA and the acetyltransferase GcnE, a component of the SAGA complex, was confirmed by Split YFP and the interaction site was mapped. Another interaction of RlcA with SsnF, a protein of a corepressor complex, could only be obtained with full length proteins. There was no interaction of the mutated version of RlcA and SsnF. In this PhD thesis a new regulatory complex was found which is involved in the regulation of light inducible genes and chromatin remodelling.
The ability to sense light offers the opportunity for an enhanced preparation of metabolic processes to adjust them to daily rhythms. In N. crassa a circadian clock, which consists of an autoregulatory negative feedback loop, drives the expression of genes in a regulatory manner. Until now such a circadian clock couldn´t be found in Aspergillus nidulans.
Some of the components of the N. crassa core clock are present in A. nidulans, the WC homologs LreA and LreB, but important components such as FRQ or VVD are not present.
In the bd strain of N. crassa, which has a mutation in the ras-1 gene, a clear circadian sporulation can be seen. By introducing a mutation in the rasA gene, which is responsible for the banding phenotype in N. crassa, a circadian sporulation of A. nidulans should have been obtained. By driving temperature cycles A. nidulans strains harbouring the mutation in rasA showed a ring formation. Using a luciferase reporter system, a circadian expression of the luciferase under ccgA promotor could be observed in temperature cycles. For free runs in constant temperature and light a rhythmic expression of ccgA, conJ and gpdA could be observed in red light.