Polymeric Nanocarriers for the Visualisation and Quantification of Molecular Release

Makromolekulare Konstrukte zur Verabreichung von Chemotherapeutika stellen ein weitläufig etabliertes Konzept im Feld der Krebstherapie dar. Mit einem reichen Angebot ver-fügbarer Strategien zu gerichtetem Transport von anti-Tumor Therapeutika bedarf es nach wie vor eingehender Untersuchung und Quantifizierung von korrekter Lokalisierung und Freisetzung von derartigen makromolekularen Transportern. Die vorliegende Arbeit legt den Fokus auf die Synthese und Evaluierung solcher Systeme. Mit pH-gesteuerten und lichtabhängigen Ansätzen wurden zwei Herangehensweisen zur fluoreszenzbasierten Detektion von Wirkstofffreisetzung eingehend untersucht. ... mehrFokus der hier demonstrierten Systeme lag auf der Ausnutzung fluoreszenzlöschender Eigenschaften von Nitroxiden, um ein wellenlängenunabhängiges System zu etablieren.
Der erste Abschnitt der vorliegenden Arbeit setzt sich mit dem Entwurf und der syntheti-schen Umsetzung eines Polymethacrylat-basierten Transportkonstrukts zur Quantifizie-rung von pH-abhängiger Freisetzung auseinander. Eine geeignete Herangehensweise an die Kombination von Nitroxiden und hydrolytisch spaltbaren Hydrazonen, gebunden an PEGylierte Methacrylate ist eingehend beschrieben. Zwei Architekturen wurden untersucht. Eine Strategie basierte auf der Verankerung von Hydrazon und Nitroxid an dersel-ben Glycidylgruppe eines RAFT Copolymers aus Glycidylmethacrylat und Triethylenglycolmethacrylat (TEGMA). Die andere Strategie legte eine statistische RAFT-Copolymerisation von 2,2,6,6-Tetramethyl-4-Piperidylmethacrylat (TMPMA), Hydrazid-vorläufern in Form von tert-butoxycarbonyl-hydrazido Methacrylat (bHMA), und TEGMA zugrunde. Mithilfe letzterer Strategie konnten erfolgreich Polymere mit TEMPO-Seitenketten und freien Hydraziden zur Beladung mit Doxorubicin (Dox) synthetisiert werden. Der fluoreszenzbasierte Nachweis pH-kontrollierter Freisetzung konnte erfolg-reich gezeigt werden. Des Weiteren wurde das Konstrukt erfolgreich in zwei- und drei-dimensionaler Zellkultur auf Aktivität in biologischen Systemen untersucht. Im Zuge der biologischen Untersuchungen wurde ein Ansatz zur computergestützten Auswertung von konfokalen Fluoreszenzmikroskopieaufnahmen erstellt. Die vorgestellte Methode erlaubte nicht nur Quantifizierung der Wirkstoffaufnahme, sondern auch eine Abschätzung der Eindringtiefe fluoreszenter Konstrukte in Tumorsphäroide. Eine Erweiterung der Transporterplattform im Hinblick auf die Coimmobilisierung von Nitroxid und Wirkstoff an derselben Seitenkette eines Polymers einerseits, und die Einbindung eines rotverschobenen zweiten Fluorophors andererseits, wurde basierend auf der Ugi-Reaktion ebenfalls unternommen.
Der zweite Abschnitt dieser Arbeit stellt ein Freisetzungssystem, basierend auf der Nutzung eines Lichtstimulus aus dem sichtbaren Spektrum, vor. Die erfolgreiche Immobilisierung von Pyrenacylsulfid als photolytisch spaltbarer Gruppe und Modellfluorophor in ei-nem, und Amino-TEMPO als fluoreszenzlöschendem Nitroxid konnte erfolgreich gezeigt werden. Das System nutzt ein RAFT-basiertes Copolymer von Methylmethacrylat und Formylphenylmethacrylat zur Bereitstellung einer carbonylfunktionalen Polymerplattform. Das Gesamtkonstrukt wurde in einem eleganten Multikomponentenschritt nach Ugi zu-sammengefügt.
Der dritte und letzte Abschnitt untersucht die Anwendbarkeit der Erkenntnisse aus den ersten beiden Teilen zur Konstruktion eines neuartigen Farbstoffs für optoakustische Bildgebung. Ein mit Cyanin-5 endgruppenfunktionalisiertes RAFT poly-TMPMA Kon-strukt wurde erfolgreich synthetisiert und im Hinblick auf seine fluroeszenten Eigenschaf-ten untersucht.
Zusammenfassend stellt diese Thesis zwei vielversprechende Werkzeuge zur Visualisierung und Quantifizierung molekularer Freisetzung von polymerbasierten Transporterkonstrukten vor. Darüber hinaus wurde eine Anwendbarkeit in biologischen Systemen erfolgreich demonstriert.

Macromolecular assemblies for the delivery of chemotherapeutics pose a widely established tool in the field of cancer therapies. With a broad variety of biocompatible strategies to immobilise and release anti-tumour therapeutics readily available, quantification of both delivery and molecular release needs deeper investigation. This thesis focuses on the synthesis and investigation of such macromolecular transporter systems. With pH- and light-triggered release, two avenues of fluorescence-based reporting were explored. The central feature of the reporting systems presented in this thesis was the exploitation of nitroxides as quenchers, to establish a wavelength-independent architecture.
... mehr
The first part of the works presented herein focuses on the design and synthesis of a polymethacrylate-based transporter assembly for the quantification of pH-triggered re-lease. It encompassed the utilisation of nitroxides as quenchers in combination hydrolytically labile hydrazone-anchoring moieties on defined, PEGylated methacrylates. Two approaches were explored. The first approach focussed on the immobilisation of fluorophore and nitroxide on the same repeating unit of a statistical RAFT copolymer of glycidyl methacrylate and triethylene glycol methacrylate (TEGMA). In the second approach, nitroxide precursors in the form of 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl methacrylate (TMPMA), hydrazide precursors in the form of tert-butoxycarbonyl-hydrazido methacrylate (bHMA), and TEGMA were statistically copolymerised via RAFT. The second approach could successfully yield nitroxide-loaded polymers with free hydrazides for the conjugation of doxorubicin (Dox). The fluorescence-based monitoring of pH-triggered release of Dox was successfully demonstrated for the synthesised architecture. The assembly was subsequently tested in 2D and 3D cell culture in an effort to both evaluate biological activity and investigate the effect of polymeric assemblies on spheroidal 3D cell culture models. In the course of the biological investigations, a refined approach for the computer-assisted evaluation of confocal microscopy images was established. The method allowed the evaluation of drug-penetration into tumour spheroids. The expansion of the nanocarrier towards immobilisation of both fluorophore and nitroxide on one repeating unit via adoption of Ugi-reaction based ligation chemistry was explored. Additionally the possibility of extending the reporter system by a second, red-shifted fluorophore was investigated.
In the second section of this thesis, a release system, photo-responsive to visible light was established. A successful immobilisation of pyreneacyl sulfide as a photolytically cleavable fluorophore and linker moiety, and amino-TEMPO as a nitroxide quencher could be demonstrated. The system was based on a statistical RAFT copolymer of methyl methacrylate and formylphenyl methacrylate as anchor units. The assembly was coupled in a multicomponent chemistry approach by Ugi-reaction protocols.
The third and last section explored the applicability of findings from the first two project for the creation of an optoacoustic-imaging agent. An end group functionalised RAFT poly-TMPMA was successfully synthesised and examined for its fluorescent properties.
In summary, two powerful tools for the visualisation and quantification of molecular re-lease from polymeric carrier platforms are presented. Additionally, bioapplicability of one of the assemblies is demonstrated.