Transformation of the filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna: Electroporation versus Natural Transformation

Der Großteil der aktuellen, auf Kohlenstoff basierenden Waren wird entweder aus pflanzlichen Rohstoffen oder aus Erdöl gewonnen. Die damit verbundene Nachfrage nach Ressourcen steigt auf Grund der wachsenden Erdbevölkerung und den allgemeinen Bestrebungen zur Verbesserung des Lebensstandards. Im Gegensatz dazu sind die Verfügbarkeit von Agrarflächen und fossilen Energiereserven begrenzt. Außerdem wird der Anstieg von CO2 in der Atmosphäre seit dem Beginn der industriellen Revolution im 19. Jahrhundert als Hauptbeitrag des Menschen zur globalen Erwärmung angesehen. Es gibt einige Strategien um die Abhängigkeit von fossilen Kohlenstoffquellen zu reduzieren, wie etwa die Entwicklung von regenerativen Energien oder erhöhte Energieeffizienz.
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Der Einsatz von Cyanobakterien in der Biotechnologie ist eine weitere Strategie, die das Potential besitzt Landwirtschaft und Erdölindustrie als Quelle für kohlenstoffbasierte Produkte zu ersetzen. Produkte, die sich von Cyanobakterien oder Pflanzen ableiten, führen nicht zur Erhöhung des CO2 Gehalts in der Atmosphäre. Im Vergleich zu Landpflanzen ist die Kultivierung von Cyanobakterien nicht abhängig von fruchtbarem Land und viele Arten der Cyanobakterien weisen höhere Wachstumsraten als Pflanzen auf. Außerdem sind einige Cyanobakterien genetisch manipulierbar, wodurch die Synthese natürlicher Produkte verstärkt werden kann oder die rekombinante Produktion von neuen Stoffen möglich ist. Die mögliche Produktpalette reicht von preiswerten Verbindungen, wie Biokraftstoffen, bis hin zu hochwertigen Produkten, wie pharmazeutischen Wirkstoffen.
Auch wenn es im Bereich der rekombinanten Biotechnologie mit Cyanobakterien schon kommerzielle Anwendung gibt, befindet sich das gesamte Feld dennoch in seinen Kinderschuhen. Während im Bereich der metabolischen Optimierung, der molekularen Werkzeuge und der Bioreaktorentwicklung in den letzten Jahren und Jahrzehnten deutliche Fortschritte gemacht wurden, ist die Etablierung von neuen Organismen nach wie vor eine Herausforderung. Die Forschung konzentriert sich größtenteils auf wenige, leicht transformierbare Modelorganismen der Ordnungen Synechococcales und Nostocales, da die Etablierung von Transformationsprotokollen für neue Stämme und Arten oft eine Herausforderung darstellt. Allerdings wird die rekombinante Biotechnologie mit Cyanobakterien ohne ein breites Spektrum an nutzbaren Stämmen möglicherweise hinter ihrem Potential zurück bleiben, da vorteilhafte Eigenschaften von vielversprechenden Kandidaten nicht genutzt werden können.
Diese Arbeit setzt sich mit der beschriebenen Limitierung auseinander, indem ein verlässliches und effizientes Transformationsprotokoll für Phormidium lacuna etabliert wurde. Diese Art wurde kürzlich von unserer Arbeitsgruppe als vielversprechend für die cyanobakterielle Biotechnologie charakterisiert. Da die Gattung Phormidium bislang noch nicht für genetische Manipulation zugänglich war, war es das Ziel dieser Arbeit ein Transformationsprotokoll zu entwickeln und das Potential für die Biotechnologie an Hand der rekombinanten Ethanolsynthese zu charakterisieren. Die rekombinante Produktion von Ethanol ist gut charakterisiert innerhalb der cyanobakteriellen Biotechnologie und ermöglicht den Vergleich mit anderen Cyanobakterien hinsichtlich Produktivität.
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Bei der Etablierung eines Protokolls zur Elektroporation wurde deutlich, dass Phormidium lacuna natürlich transformierbar ist. Natürliche Transformation ist bislang nur für wenige Stämme der Cyanobakterien beschrieben und dies ist der erste Bericht für die Ordnung Oscillatoriales. Natürliche Transformation erlaubt verlässlichen und effizienten Gentransfer mittels homologer Rekombination in Phormidium lacuna. Die Integration des Selektionsmarkers kanR ins Genom von Phormidium lacuna vermittelt eine deutliche Resistenz gegenüber Kanamycin (bis zu 14,3 mg/ml). Die kanR Sequenz verteilt sich sehr schnell in allen Genomkopien: Nach zwei Kulturzyklen nach der ersten Kultivierung der entsprechenden Transformanten war die kanR Sequenz in allen Genomkopien einer Zelle vorhanden.
Phormidium lacuna Transformaten für die rekombinante Ethanolproduktion wurden generiert indem die codierenden Sequenzen für die Enzyme Pyruvatdecarboxylase und Alkoholdehydrogenase ins Genom integriert wurden. Die Ethanolproduktion wurde über die Ethanolkonzentration im Kulturüberstand mittels Gaschromatographie nachgewiesen. Allerdings konnte keine erhöhte Ethanolproduktion von Transformanten im Vergleich zum Wildtyp von Phormidium lacuna nachgewiesen werden. Mögliche Gründe hierfür und geeignete Schritte in Richtung einer biotechnologischen Anwendung von Phormidium lacuna wurden diskutiert.
Der unerwartete Fund der natürlichen Transformation für Phormidium lacuna ist möglicherweise ein Hinweis darauf, dass die Fähigkeit zu natürlicher Transformation weiter unter den Cyanobakterien verbreitet ist, als bislang angenommen wurde. Um diese Fragestellung zu adressieren wurden der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit und die weiteren Beispiele, die in der Literatur beschrieben sind, mit den Cyanobakterien im Allgemeinen verglichen. Basierend auf der Homologie zu Proteinen, die an der natürlichen Transformation beteiligt sind, wurden cyanobakterielle Stämme vorgeschlagen, die potentiell transformierbar sind.
Der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit hat viele Implikationen. Erstens: Phormidium lacuna ist nun effizient natürlich transformierbar, was eine essentielle Voraussetzung für die weiteren Arbeitsschritte mit diesem Organismus in Bereich der rekombinanten Biotechnologie darstellt. Zweitens: Da Phormidium lacuna leicht transformierbar ist und homozygote Transformanten in kurzer Zeit generiert werden können, bietet sich dieses Bakterium als vielversprechender Modellorganismus der filamentösen Cyanobakterien ohne Heterocysten an. Drittens: Der Fund von natürlicher Transformation in einer neuen Ordnung der Cyanobakterien weiß vermutlich daraufhin, dass natürliche Kompetenz eine weit verbreitete Eigenschaft innerhalb der Cyanobakterien ist und dass möglicherweise deutlich mehr Stämme zugängliche für rekombinante Biotechnologie sind.

Our present consumption of organic commodities mostly relies on plant material or mineral oil. The related demand for resources is increasing due to the increase of world’s population and overall efforts for improved standards of living. This is in conflict with the limited availability of arable land and decreasing reserves of fossil fuels. Furthermore, the release of CO2 into the environment by the increasing use of fossil energy since the industrial revolution in the 19th century is regarded as main anthropogenic contribution to the global climate change. Several strategies exist to decrease the dependency on mineral carbon sources like the development and use of alternative energy sources and increasing energy efficiency.
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The use of cyanobacteria in biotechnology is an additional strategy that has the potential to supplement agriculture and fossil fuel industry as source of carbon based compounds. Products originating from cyanobacteria and plants are not related to the release of new CO2 into the atmosphere. In comparison to plants the cultivation of cyanobacteria is not dependent on arable lands and many cyanobacterial species show higher growth rates than plants. Furthermore, several cyanobacteria are accessible for genetic manipulation, which allows to improve the synthesis of original products or to facilitate the production of recombinant compounds. The range of possible products from cyanobacterial biotechnology encompasses low value products like biofuels up to high value compounds for pharmaceutics.
Although there are already commercial companies in the field, application of cyanobacterial biotechnology is still in its infancy. While remarkably progress has been made in the field of metabolic engineering, molecular tools, and bioreactor design in the last decades, the establishment of new organism in the field is still challenging. Research mainly focuses on the few easily transformable model organisms of the orders Synechococcales and Nostocales since the establishment of transformation protocols for new strains and species is often challenging among the phylum of cyanobacteria. But without a broad spectrum of accessible strains for cyanobacterial biotechnology, this field may stay behind its potential, since beneficial properties of potential producer strains are not useable.
This study addresses this limitation by the establishment of a reliable and efficient transformation protocol for Phormidium lacuna. This species was characterized with promising traits for cyanobacterial biotechnology by our workgroup recently. As the genus Phormidium was not accessible for genetic manipulation so far, the aim of this study was to establish a protocol for gene transfer into Phormidium lacuna and to characterize its potential for recombinant biotechnology with the heterologous production of the biofuel ethanol. The recombinant production of ethanol is well characterized in cyanobacterial biotechnology and allows the comparison with other cyanobacteria in terms of productivity.
During the establishment of gene transfer into Phormidium lacuna via electroporation, it was discovered that this organism is capable of natural transformation. The process of natural
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transformation has only been described for a few cyanobacterial strains before and this is the first report for the order Oscillatoriales. Natural transformation allows reliable and efficient gene transfer into Phormidium lacuna via homologous recombination. Integration of the selection marker kanR into the genome mediates a considerably high resistance against kanamycin for Phormidium lacuna transformants (up to 14.3 mg/ml). The kanR sequence segregates very fast in the genome: After two cultivation cycles following the first cultivation of Phormidium lacuna transformants in suspension culture, the kanR sequence was present in all genome copies in a cell.
Phormidium lacuna transformants for ethanol production were generated by the integration of the coding sequences for pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase into the genome. Ethanol production was monitored by the ethanol content in culture supernatant using gas chromatography. However, no increased ethanol production could be demonstrated for any transformant in comparison to the wild type of Phormidium lacuna. Probable reasons for this finding and suitable further steps towards the biotechnologically application of Phormidium lacuna were discussed.
The unexpected finding of natural transformation in Phormidium lacuna indicate that natural transformation is a more common trait among the cyanobacteria than previously thought. To address this hypothesis, the findings of natural transformation in Phormidium lacuna in this study and other examples of natural transformation in literature were set into relation to the phylum of cyanobacteria. With a homology based study on the sequences of proteins, which are involved in natural transformation, several other cyanobacterial strains were predicted by bioinformatics to be potentially naturally transformable.
The finding of natural transformation has many implications. First, Phormidium lacuna is now efficiently genetically manipulable, which is an essential prerequisite for further work with this organism in respect to recombinant biotechnology. Second, since Phormidium lacuna is easily transformable and also homozygous transformants can be generated in short time, this organism might be an interesting model for filamentous cyanobacteria without heterocysts. Third, the finding of natural transformation in a new order of cyanobacteria might indicate that natural transformation is a more common trait among cyanobacteria and more strains might be easily accessible for recombinant work.