Enzymatic Production Of Chiral Non-Canonical Amino Acids With Decarbamoylating Enzymes

Chirale nicht-kanonische Aminosäuren, wie β-Aminosäuren, existieren in unzähligen Varianten. Die Entwicklung eines geeigneten Verfahrens zu ihrer biotechnologischen Herstellung ist zwingend erforderlich, da sie als Bausteine von Medikamenten diesen neue biologische Eigenschaften verleihen. Ihre chemische Synthese ist oft aufwändig und bietet viele weitere Nachteile im Vergleich zu biotechnologischen Verfahren. Durch enantioselektive Enzyme kann beispielsweise eine 100 %-ige Ausbeute eines Enantiomers erzielt werden. Der etablierte Hydantoinaseprozess wird industriell erfolgreich zur enzymatischen Synthese nicht-kanonischer D-α-Aminosäuren verwendet. ... mehrZiel dieser Arbeit war es, neue Enzyme für einen modifizierten Hydantoinaseprozess zur Herstellung optisch reiner β3-Aminosäuren zu identifizieren.
Dafür wurden mehrere Enzymsubstrate, wie beispielsweise N-carbamoyl-β-homo-serin oder N-carbamoyl-β-phenylalanin (NCβPhe) chemisch synthetisiert. Passende analytische Assays und HPLC-Methoden wurden etabliert, um den enzymatischen Substratabbau und Produktaufbau zu verfolgen. Um neue Enzyme zu identifizieren, die N-carbamoyl-β- Aminosäuren zur entsprechenden β-Aminosäure katalysieren, wurden 200 Wildtyp-Stämme der institutseigenen Mikroorganismenstammsammlung auf Wachstum auf NCβPhe als einziger Stickstoffquelle untersucht. Für einige Stämme konnte ein geringes Wachstum beobachtet werden. Mit Hilfe von bioinformatischen Sequenzvergleichen konnten sieben Gene aus drei verschiedene Organismen (Burkholderia phytofirmans, Pseudomonas aeruginosa und Pseudomonas oleovorans) identifiziert werden, für die eine putative Synthese von β-Aminosäure angenommen wurde. Diese Gene wurden kloniert und rekombinant in Escherichia coli exprimiert. Zwar zeigte keines der Enzyme einen Umsatz von NCβPhe, allerdings konnte erstmals die enzymatische Synthese von L-β-Homo-alanin und L-β-Homo- serin sowie anderen nicht-kanonischen α-Aminosäuren gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Aktivzentren dieser sieben neuen Enzyme mit Hilfe verschiedener in silico Methoden prognostiziert. Des Weiteren wurden die Enzyme durch in vitro und in silico Experimente charakterisiert und klassifiziert.
Im Verlauf der Arbeit wurden fünf weitere bereits aus der Literatur bekannte decarbamoylierende Enzyme aus vier unterschiedlichen Enzymklassen untersucht. Für diese Enzyme konnten bisher nicht bekannte klassenübergreifende Aktivitäten detektiert werden. Außerdem konnten durch Katalyse dieser Enzyme erstmals die β3-Aminosäuren L- und D-β-
Homo-Alanin, L- und D-β-Homo-Serin, L-β-Homo-Methionin, sowie die nicht-kanonischen α-Aminosäuren β-2-Thienylalanin, L-α-Neopentylglycin biokatalytisch hergestellt werden. Durch Kombination von Ergebnissen aus in silico Ligand-Dockings und in vitro Experimenten konnte eine Affinität aller Enzyme gegenüber Substraten mit polaren oder geladenen Seitenketten prognostiziert werden.

Chiral non-canonical amino acids like β-amino acids exist in countless variants. The development of a suiting biotechnological production process for them is mandatory, since they are used as components in many drugs and lend them novel bioactive properties. The chemical synthesis of non-canonical amino acids is often elaborate and has many disadvantages. By using enantioselective enzymes a 100 % yield of an enantiomers can be achieved. The established Hydantoinase process is successfully applied in industry for the production of non-canonical D-α-amino acids. The aim of this work was to identify enzymes for a modified Hydantoinase process to synthesize optically pure β3-amino acids.
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Therefore, several novel enzyme substrates like N-carbamoyl-β-homo-serine or N-carbamoyl- β-phenylalanine (NCβPhe) were chemically synthesized. Suiting analytical assays and HPLC- methods were established to monitor enzymatic substrate degradation and product formation. To identify one or more new enzymes able to convert N-carbamoyl-β-amino acids 200 wild- type strains of the institutes own microorganism strain collection were screened for growth on N-carbamoyl-β-phenylalanine as the sole nitrogen source. Some strains showed growth on NCβPhe. By using bioinformatic sequence alignment tools seven genes from three bacterial strains (Burkholderia phytofirmans, Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas oleovorans) were identified for potential production of chiral β-amino acids. These genes were cloned and recombinantly expressed in Escherichia coli. Although none of the enzymes showed degradation of NCβPhe, the enzymatic synthesis of L-β-homo-alanine and L-β-homo-serine as well as other non-canonical α-amino acids was shown for the first time using decarbamoylating enzymes. In addition, the active centres of these seven novel enzymes were predicted using various in silico methods. Furthermore, the enzymes were characterized and classified by in vitro and in silico experiments.
In the course of the work five further decarbamoylating enzymes from four different enzyme classes already known from the literature were examined. For these enzymes, previously unknown cross-class activities could be detected. In addition, catalysis of these enzymes made it possible for the first time to synthesize the β3-amino acids L- and D-β-homo-alanine, L- and D-β-homo-serine, L-β-homo-methionine, as well as the non-canonical α-amino acids β-2-thienylalanine, L-α-neopentylglycine biocatalytically. By combining results from in silico ligand docking and in vitro experiments, an affinity of all enzymes to substrates with polar or charged side chains could be predicted.