Improvement of the electron transfer in S. oneidensis and production of glucose-based platform chemicals

Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war es, die Elektronentransferrate des Mikroorganismus S. oneidensis MR-1 auf Anodenoberflächen zu verbessern und mit seiner Hilfe Itakonsäure ausgehend von Glukose als neuem Substrat zu produzieren. Aufgrund der Komplexität dieses Vorhabens wurde die Doktorarbeit in drei Teilprojekte aufgeteilt.
Das erste Teilprojekt basierte auf der Hypothese, dass eine Reduktion der Komplexität des periplasmatischen Elektronentransfernetzwerks und eine anschließende Überexpression des wichtigen periplasmatischen Elektronen-Shuttle-Cytochroms STC zu einer Beschleunigung der Elektronentransferrate und somit des gesamten Metabolismus führen könnte. ... mehrGenauer gesagt, wurden die periplasmatischen Cytochrome NrfA, CcpA, NapB und das Protein NapA mit STC ersetzt, was zu einer 3,6-fach erhöhten Expression des STC kodierenden Gens cctA und einem 2,5-fachen Anstieg der periplasmatischen Flavin-Konzentration führte. Die resultierende 4-fach Mutante zeigte in anoxischen Zellsuspensionsassays mit Eisencitrat als Elektronenakzeptor eine 1,7-fach erhöhte Elektronentransferrate im Vergleich zu S. oneidensis MR-1. Des Weiteren war die erreichte Gesamtstromproduktion in bioelektrochemischen Systemen mit einer Graphit-Fleece-Elektrode als Elektronenakzeptor unter anoxischen Bedingungen mit der entwickelten 4-fach Mutante 1,5-fach höher. Außerdem war es möglich zu zeigen, dass eine bisher vermutete Redundanz von STC und FccA im Elektronentransfer nicht komplett gegeben ist, da eine zusätzliche Substitution von FccA mit STC zu Elektronentransferraten auf Wildtyp-Niveau führte.
Im zweiten Teilprojekt wurden verschiedene Strategien getestet, um Shewanella zu ermöglichen Glukose als Substrat zu nutzen. Dabei war das Einsetzen eines Plasmids mit den Genen für den Glukosetransporter GalP und die Kinase Glk aus E. coli die effizienteste Strategie. Die Kombination aus dieser Strategie und dem im ersten Teilprojekt entwickelten Chassis-Stamm erlaubten es Shewanella 50 mM Eisen(III)citrat innerhalb von 24 h komplett zu reduzieren. Im Vergleich von 4-fach Mutante mit Glukose-Modul und Wildtyp mit Glukose-Modul konnte ein 1,7-fach schnellerer Glukoseverbrauch festgestellt werden. Eine andere getestete Strategie – die Deletion des Repressors NagR – stellte sich unter anoxischen Bedingungen als wirkungslos heraus.
Das dritte Teilprojekt zielte auf die Ermöglichung der Glukose-basierten Itakonsäure-Produktion ab, weshalb das zuvor getestete Glukose-Modul sowie das Enzym CadA von Aspergillus terreus in einem Plasmid in Shewanella eingefügt wurden. Zusätzlich wurden verschiedene Gene deletiert, um die metabolische Komplexität zu reduzieren und die Produktion von Nebenprodukten zu vermeiden. Genauer gesagt wurden die Gene sucCD, pykA, aceA, ptA und ackA aus dem Genom entfernt. Zellsuspensionsassays unter oxischen und anoxischen Bedingungen zeigten, dass die Produktion von kleinen Itakonsäure-Mengen nur unter oxischen Bedingungen möglich war. Wegen der geringen Mengen von Itakonsäure, die während dieser Experimente produziert werden konnten, wäre weitere Forschung an der Stammoptimierung notwendig. Nichtsdestotrotz konnte gezeigt werden, dass die Integration von cadA die Itakonsäure-Produktion ermöglicht und somit das grundlegende Konzept valide ist.

The main aim of this thesis was to accelerate the extracellular electron transfer to an anode catalyzed by the microorganism S. oneidensis MR-1 and to enable the production of itaconic acid based on glucose as a new substrate. Due to the complexity, the thesis was divided into three sub-projects.
The first sub-project was based on the hypothesis that a reduction of the complexity of the periplasmic electron transfer network and a subsequent overexpression of the crucial periplasmic electron shuttling cytochrome STC could lead to an acceleration of the electron transfer rate and, thereby, of the whole metabolism. ... mehrIn particular, the periplasmic cytochromes NrfA, CcpA, NapB and the protein NapA were substituted with STC, which led to a 3.6-fold increased expression of cctA encoding STC and a 2.5-fold increase of the periplasmic flavin concentration. The resulting quadruple mutant showed a 1.7-fold increased electron transfer rate compared to S. oneidensis MR-1 in anoxic cell suspension assays with ferric iron citrate as electron acceptor. Also, the achieved total current production in bioelectrochemical systems with a graphite fleece electrode as electron acceptor under anoxic conditions was 1.5-fold higher with the developed quadruple mutant. Besides, it was possible to demonstrate that a so far suspected redundancy of STC and FccA in the electron transfer is not completely given because the additional substitution of FccA with STC led to electron transfer rates similar to the wild type.
In the second sub-project, different strategies of enabling glucose consumption in Shewanella were tested. Inserting a plasmid containing the genes for the glucose transporter GalP and the kinase Glk from E. coli resulted as the most efficient strategy. The combination of this strategy with the developed chassis strain from the first sub-project enabled Shewanella to reduce 50 mM ferric iron citrate completely within 24 h. A 1.7-fold faster glucose consumption could be observed in the quadruple mutant comprising the glucose module compared to the wild type comprising the glucose module. Another tested strategy – the deletion of the repressor NagR – was revealed to be ineffective under anoxic conditions.
The third project aimed at facilitating a glucose-based itaconic acid production by introducing a plasmid comprising the previously tested glucose module and the enzyme CadA from Aspergillus terreus. Additionally to the insertion of cadA, various genes were knocked out in order to reduce the metabolic complexity and to avoid the production of by-products. More specifically, the genes sucCD, pykA, aceA, ptA and ackA were deleted. Cell suspension assays under oxic and anoxic conditions revealed that the production of small quantities of itaconic acid was only possible under oxic conditions. Due to the small quantities of itaconic acid obtained during these experiments, further investigation on optimizing the strain would be necessary. Nevertheless, the concept of facilitating itaconic acid production by inserting cadA could be proven valid.