Abstract:
Die Superfamilie der Transient Receptor Potential (TRP)-Ionenkanäle ist eine große Gruppe von Kationenkanälen, die in einer Vielzahl fundamentaler physiologischer Prozesse involviert sind. Innerhalb der TRP-Familie weist der TRPV6- (Transient Receptor Potential Vanilloid Subfamily Member 6), neben dem TRPV5-Ionenkanal, die größte Selektivität für Ca2+ auf (PCa/PNa>100). Der TRPV6-Ionenkanal ist in apikalen Membranen von Ca2+-transportierenden Epithelien verschiedener Gewebe unterschiedlich stark exprimiert und spielt in der Aufnahme von Calcium-Ionen eine wichtige Rolle. ... mehrEine veränderte TRPV6-Expression ist mit einer Reihe verschiedener Erkrankungen, einschließlich zahlreicher Tumorarten, assoziiert.
Die Translation des humanen TRPV6-Proteins wird an einem nicht-kanonischen ACG-Startcodon initiiert, das 120 Nukleotide stromaufwärts, im gleichen Leseraster des ersten kanonischen AUG-Startcodons liegt. Das resultierende humane full-length TRPV6-Protein besteht aus 765 Aminosäuren (NM_018646). Das zunächst annotierte Protein mit 725 Aminosäuren stellt somit eine N-terminale Deletionsvariante dar. Die Sequenz der zusätzlichen 40 Aminosäuren weist keine Ähnlichkeit zu anderen bekannten Proteinsequenzen auf. Die heterologe Expression des full-length TRPV6-Proteins als auch der Deletionsvariante führte in Säugetier-Zelllinien zu funktionellen Ionenkanälen. Mit der vorliegenden Dissertation wurde das Ziel verfolgt, die Ionenkanal-Eigenschaften des humanen full-length TRPV6-Proteins und der TRPV6-Deletionsvariante in lebenden Zellen vergleichend zu analysieren und dadurch Hinweise auf mögliche Funktionen der zusätzlichen 40 N-terminalen Aminosäuren zu erhalten. Dazu wurden TetOn-regulierbare, stabile Zelllinien entwickelt, die das humane full-length TRPV6-Protein bzw. die TRPV6-Deletionsvariante als Fusionsprotein mit einem C-terminalen mCherry-Fluoreszenztag exprimierten. Durch die stabile, regulierbare Expression in CHO-K1-Zellen konnte eine bessere Vergleichbarkeit der Daten erzielt werden. Das TRPV6-mCherry-Fusionsprotein erlaubte die Quantifizierung der hTRPV6-Überexpression parallel zum Calcium-Imaging als auch subzelluläre Lokalisationsstudien. Bei gleicher Doxyzyklin-Induktion war die Deletionsvariante 3-fach höher exprimiert als das full-length TRPV6-Protein. Beide Varianten der TRPV6-Ionenkanäle waren in den Überexpressionsmodellen funktionell aktiv.
Die Bestimmung der Aktivität der in den stabilen Zelllinien exprimierten humanen TRPV6-Ionenkanäle bzw. der deletierten Ionenkanalvariante erfolgte durch nicht-ratiometrische Bestimmung der Änderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i). Für die Analysen wurde ein Flusskammermodell etabliert. Die Messungen der [Ca2+]i wurde in den Zellmodellen in Abhängigkeit von der durch Doxyzyklin-induzierten TRPV6-Expressionshöhe und einer Thapsigargin-Behandlung zur Entleerung der intrazellulären Ca2+-Speicher sowie abhängig von der extrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]e), des extrazellulären pH-Wertes (pHe) und von TRPV6-Antagonisten durchgeführt. Die resultierenden, durch TRPV6-vermittelten Änderungen der [Ca2+]i konnten durch Calcium-Imaging sehr gut aufgelöst und verglichen werden. Durch die internen Kontrollen war es möglich, Ca2+-Einströme, die nicht durch TRPV6-Ionenkanäle vermittelt wurden, zu quantifizieren. Aus den vergleichenden Analysen der [Ca2+]i konnte abgeleitet werden, dass die humanen full-length TRPV6-Ionenkanäle nach Erhöhung der [Ca2+]i, [Ca2+]e und pHe schneller und stärker inhibiert werden als die TRPV6-Deletionsvariante. Bei der pharmakologischen Testung der Zellen mit den Antagonisten Ruthenium Red, La3+, 2-APB und SOR-C13 waren die IC50-Werte für den TRPV6-spezifischen Peptid-Inhibitor SOR-C13 auffallend unterschiedlich: in den Zellen mit Expression der TRPV6-Deletionsvariante war der IC50-Wert 71-fach niedriger als in Zellen mit Expression der full-length TRPV6-Ionenkanäle.
Zusätzlich wurde der Einfluss der Überexpression der TRPV6-Ionenkanäle auf Ca2+-abhängige zellphysiologische, einschließlich pathophysiologischer Prozesse, wie Vesikeltransport, Proliferation, Migration, Invasion und Aktivierung des NFAT-Signalwegs untersucht. Bei der Analyse des Vesikeltransportes ergaben sich erste Hinweise auf eine unterschiedliche Regulation der beiden TRPV6-Varianten. Die TRPV6-Deletionsvariante war stärker mit Rab7 kolokalisiert, während das full-length TRPV6-Protein eine stärkere Kolokalisation mit Rab11 aufwies.
Die Analyse einer TRPV6-vermittelten Aktivierung des NFAT-Signalweges erfolgte auf der Basis eines Luciferase-Assays. Beide TRPV6-Varianten aktivierten den NFAT-Signalweg, allerdings war die NFAT-Aktivierung durch die Deletionsvariante im Vergleich zum full-length TRPV6 2-fach höher. Die Überexpression der beiden TRPV6-Varianten führte weiterhin zu einer 1,4-fach erhöhten Migrationsgeschwindigkeit der Zellen.
In Zusammenfassung aller gezeigten Resultate konnten signifikante, funktionelle Unterschiede zwischen der TRPV6 Deletionsvariante und dem full-length TRPV6-Ionenkanal ermittelt werden, die anzeigen, dass die zusätzlichen 40 Aminosäuren der verlängerten N-terminalen Region einen Einfluss auf die Ca2+-abhängige Inaktivierung des Ionenkanals sowie auf die NFAT-Aktivierung haben. Darüber hinaus weisen die IC50-Werte für den SOR-C13 Inhibitor darauf hin, dass der full-length TRPV6-Ionenkanal im Vergleich zur Deletionsvariante möglicherweise eine unterschiedliche Konformation einnimmt, die die Bindung des Peptid-Inhibitors erschwert.
Abstract (englisch):
The superfamily of transient receptor potential (TRP) ion channels constitutes a large group of cation channels contributing to a variety of fundamental physiological processes. Within the TRP family, the TRPV6 (Transient Receptor Potential Vanilloid Subfamily Member 6) and its close homolog TRPV5 are unique among all TRP channels because of their high selectivity for Ca2+ over monovalent cations (PCa / PNa> 100). TRPV6 is known to be expressed in the apical membrane of Ca2+-transporting epithelial tissues in various amounts and plays an important role in the absorption of calcium ions. ... mehrAberrant expression of TRPV6 channels results in various diseases, including numerous types of cancer.
Translation initiation for the human TRPV6 protein occurs at a non-canonical ACG start codon located 120 nucleotides upstream in an overlapping reading frame of the first canonical AUG start codon. The resulting human full-length TRPV6 protein consists of 765 amino acids (NM_018646). The originally annotated protein with 725 amino acids in length thus represents an N-terminal deletion variant. The additional 40 amino acids shared no similarity to any known protein sequence. Heterologous expression of full-length TRPV6 as well as the deletion variant resulted in functional ion channels in mammalian cell lines.
The aim of the work described in this thesis was to compare the ion channel properties of the human full-length TRPV6 protein with those of the TRPV6 deletion variant in living cells in order to elucidate possible functions of the additional 40 N-terminal amino acids. Thus, a stable expression system was developed to express a C-terminal tagged human TRPV6-mCherry fusion protein. Using stable expression of TRPV6 variants in CHO-K1 cell lines increases reproducibility and comparability of data, as it eliminates the variation associated with repeated transient transfection. The expression of a chimera that consists of a fluorescent mCherry conjugated with TRPV6 provided the ability to quantify hTRPV6 expression simultaneously to calcium imaging as well as to perform subcellular localization studies.
Following induction with equal doxycycline concentrations, cells expressing the TRPV6 deletion variant showed a threefold higher expression than the full-length TRPV6 protein. The expression of functional TRPV6 channels for both variants were proven. Non-ratiometric calcium imaging was used to determine activity of the expressed TRPV6 ion channel variants. A flow chamber model was established for the analysis. Changes in intracellular Ca2+-concentration ([Ca2+]i) were imaged in response to doxycycline induction and thapsigargin treatment depleting Ca2+ stores in the ER, as well as in response to extracellular Ca2+-concentration ([Ca2+]e), extracellular pH (pHe), and TRPV6-antagonists, respectively. The resulting changes in [Ca2+]i mediated by TRPV6 could be very well resolved and compared. Internal controls allowed to discriminate and quantify Ca2+ influx not mediated by TRPV6 ion channels. Comparative analysis of [Ca2+]i revealed differences between the two TRPV6 variants. Increases of [Ca2+]i, [Ca2+]e und pHe inhibited the Ca2+-influx mediated by the full-length TRPV6 ion channel faster and more strongly than those of the TRPV6 deletion variant.
Extracellular application of channel blockers Ruthenium Red, La3+, 2-APB, and SOR-C13 revealed substantial differences of the TRPV6-specific peptide inhibitor SOR-C13: The IC50 value was 71-fold lower in cells expressing the TRPV6 deletion variant compared to cells expressing the full-length TRPV6 ion channel.
In addition, influences in Ca2+-sensitive physiological, including pathophysiological cellular processes like vesicle trafficking, proliferation, migration, invasion, and activation of the NFAT pathway upon overexpression of ion channel variants were investigated. The results represent preliminary findings that overexpression of the TRPV6 ion channels variants might modulate vesicle trafficking in the cell model. The TRPV6 deletion variant colocalized with Rab7, whereas the full-length TRPV6 protein more frequently colocalized with Rab11.
To determine whether the overexpression of TRPV6 ion channels activates downstream NFAT pathway an NFAT-specific luciferase assay was performed. Activation of TRPV6 expression in the cell models induced a 4-fold increase mediated by the TRPV6 deletion variant and a 2-fold increase mediated by the full-length TRPV6 ion channel, respectively. Furthermore, the overexpression of the TRPV6 ion channel induced a 1.4-fold increase in migration rate.
In summary, the results indicate significant differences between the TRPV6 deletion variant and the full-length TRPV6 ion channel indicating the functional influence of the 40 amino acids extended N-terminal region on the overall TRPV6 ion channel function. This includes the Ca2+-mediated inactivation of the ion channel as well as the NFAT activation. Furthermore, the different potencies of SOR-C13 on inhibiting the TRPV6 deletion variant and the full-length TRPV6 ion channel, respectively, may reflect a different conformation of the full-length TRPV6 ion channel thereby leading to limited binding capacities of the TRPV6-specific inhibitor.
