Abstract:
Eine Vielzahl von Organismen ist in der Lage Licht, als ubiquitäres Signal wahrzunehmen. Hierfür sind Photorezeptoren notwendig, die Licht verschiedener Wellenlängen detektieren. Blaulicht wird in Pilzen duch kleine LOV Proteine, Cryptochrome oder White Collar wahrgenommen. Grünlicht wird durch Opsine und Rotlicht durch Phytochrom detektiert. All diese Proteine teilen sich die Eigenschaft einen Chromophor zu binden, um ihre Funktion zur Lichtwahrnehmung zu erhalten. Die Charakteristik bei der Absoption von Licht des Chromophors bestimmt die detektierte Wellenlänge des Proteins. ... mehrFehlt der Chromophor oder sind die Proteine nicht in der Lage diesen zu binden, führt dies zu einem „blinden“ Photorezeptor. Die Chromophore von Phytochrom aus Bakterien, Cyanobakterien und Pflanzen sind bekannt. Sie alle binden einen Bilin Chromophor und verwenden entweder Biliverdin direkt oder ein Derivat davon. All diese Organismen und Tiere bilden Biliverdin aus Häm durch Hämoxygenasen. Das Phytochrom, FphA, wurde intensiv in A. nidulans analysiert. Bei einem Mutageneseansatz wurden die HOG MAP Kinasekaskade als neue Komponente des Lichtsignalweges identifiziert. Eine putative Hämoxgenase wurde allerdings nicht gefunden. Bioinformatische Analysen ergaben auch keine Hinweise auf eine Hämoxygenase in A. nidulans. Deshalb wurde ein erneuter Mutageneseansatz mit dem Auxotrophiemarker Gen, pyr4, unter dem lichtinduzierbaren Promotor von conJ, durchgeführt. Durch komplette Genomsequenzierung wurden die Mutationen in zwei isolierten Mutanten identifiziert. Die Gene, prp8 und rsrA, waren bereits beschrieben. Prp8 ist eine Untereinheit des Spliceosoms. RsrA ist bereits aus der Wahrnehmung von oxidativem Stress bekannt und reguliert ebenfalls bereits bekannte lichtinduzierbare Gene. Der genaue Zusammenhang der beiden Gene mit der phytochromabhängigen Lichtwahrnehmung wird zurzeit in einer Master und einer Doktorarbeit unersucht. Stattdessen wurde der Fokus dieser Studie weiter auf die Hämoxygenase aus Aspergillus nidulans gelegt. Eine erneute bioinformatische Analyse des Genoms mit Domänen von Hämoxygenasen ergab tatsächlich einen Kandidaten für eine Hämoxygenase, HoxB. Da Alternaria alternata ebenfalls Rotlicht mittels Phytochrom (FphA) wahrnehmen kann, wurde dieser Organismus ebenfall in die Suche einbezogen. In A. alternata wurden sogar zwei putative Hämoxygenasen identifiziert, HoxA und HoxB, wovon HoxB homolog zu A. nidulans HoxB ist. Wie im Fall von Ho-2 aus A. thaliana fehlte in beiden HoxB das konservierte Histidin, welches für die katalytische Aktivität von anderen Hämoxygenasen essenziell scheint. Es zeigte sich, dass eine künstliche Mutation der Aminosäure an besagter Stelle zum konservierten Histidin nicht in der Lage ist, die Aktivität in vitro wiederherzustellen. Eine Deletion der Hämoxygenasegene aus A. alternata führten beide zu einem „blinden“ Phänotyp. Die Deletion von hoxB in A. nidulans hatte allerdings keinen Effekt auf die Rotlichwahrnehmung. Die Hämoxygenase Deletionsstämme aus A. alternata ähneltem dem fphA Deletionsstamm aus A. alternata. So waren die Hämoxygenase Deletionsstämme auf oxidativen Stress ebenfalls wie der fphA Deletionsstamm resistenter, wiesen aber keine Reduktion der Sporulation auf. Um die A. alternata Hämoxygenasen biochemisch zu charakterisieruen, wurden sie gemeinsam mit der photosensorischen Domäne von FphA, PGP, in E. coli exprimiert. Hierbei konnte 10x mehr funktionales FphA PGP detektiert werden, wenn beide Hämoxygenasen exprimiert wurden im Vergleich zur einzelnen Expression von HoxA. HoxB allein war nicht in der Lage, funktionales FphA PGP zu bilden. Für HoxA konnte ein C-terminaler Anker, wie er aus Hämoxygenasen aus Säugern bekannt ist, nachgewiesen werden. Zur Verbesserung der Löslichkeit wurde dieser für in vitro Studien deletiert. HoxA und HoxB waren beide in der Lage Häm in vitro zu binden, aber nur bei Anwesenheit beider Hämoxygenasen konnte der Chromophor gebildet werden. Der Chromophorsyntheseweg konnte in vitro nachgebildet werden, indem zusätzlich FphA zugegeben wurde. Durch die Fusion der Proteine mit GFP, konnte die Lokalisation am Mitochondrium nachgewiesen werden. Hierbei lokalisierten die Hämoxygenasen an der äußeren Membran der Mitochondrien. Die Hämoxygenasen bilden hierbei sowohl Homodimere als auch Heterodimere. Diese Dimere interagieren mit FphA. Hieraus ergibt sich ein neues Modell zur Chromophorsynthese und den Weg von FphA in der Zelle dar. FphA wird im Kern transkribiert und anschließend an den Ribosomen translatiert. Währenddessen wird Häm im Mitochondrium synthetisiert. Das FphA Apoprotein gelangt zu den Hämoxygenasen, um mit HoxA und HoxB zu interagieren. Häm wird derweil aus dem Mitochondrium exportiert und gelangt durch Häm-bindende Enzyme zu den Hämoxygenasen. Die Hämoxygenasen bilden aus Häm den Chromophor Biliverdin für FphA. Dieser Chromophor wird von FphA gebunden. Sobald Rotlicht wahrgenommen wird, kommt es zur Aktivierung des HOG Signalweges und zur Lichtantwort. Außerdem ist eine Funktion von FphA in den Zellkernen beschrieben, so dass eine Fraktion von Holo FphA in die Zellkerne importiert werden muss.
Abstract (englisch):
A huge variety of organisms are able to sense light as ubiquitous signal. Therefore, light receptors evolved in order to percept light of different wavelengths. In fungi, blue light is sensed by small LOV proteins, cryptochrome or white collar. Green light is perceived by green light and red light is detected by phytochrome. All these proteins have in common to bind a chromophore in order to be functional. The characteristics of the absorption of the chromophore are dictating the sensed wavelengths. In case there is no chromophore or binding is incapitated, there will be no photosensory function. ... mehrPhytochrome (FphA) was extensively studied in A. nidulans. In large scale mutagenesis components oft the light signaling pathway were indentified, but there were no components of the chromophore bionsynthesis found. In fact the chromophore of phytochrome is in plants, bacteria and cyanobacteria already known. All phytochromes bind bilin chromophors and use biliverdin directly or derivates of it. In all these organisms including animals is biliverdin catalyzed by the reaction of heme oxygenase using heme as substrate. Hence a mutagenesis screen was done using an auxotrophic strain with the pyr4 gene under control of the promotor of conJ. Previous studies suggested that this mutant is blind, but could still react to salt stress. It was hypothesized mutants of the chromophor synthesis should react in the same way, because a blind FphA is present. Surprisingly, no heme oxygenase mutants were found in the mutagenesis approach. Instead Prp8 and RsrA were identified as pontential components of the light signaling pathway. Heat stress and osmotic stress mutants were screened in the same manner, but mutations remain to be identified. Instead the focus was kept on the heme oxygenase of Aspergillus nidulans. A bioinformatic search approach using domains was successful. Henceforth the heme oxygenase is called HoxB. Since Alternaria alternata was shown also to sense red light using FphA, A. alternata was also included in the query. This led to the finding of two heme oxygenases called HoxA and HoxB. In fact, A. alternata HoxB is homologous to HoxB from A. nidulans. Like for Ho-2 from A. thaliana, HoxB lacked a conserved histidine residue, which seems to be essential for other heme oxygenase’s activity in vitro. Although mutation of the responsible residue back to histidine didn’t restore the function. While the deletion of hoxA or hoxB proofed to be blind, deletion of A. nidulans hoxB didn’t lead to a phenotype. Interestingly both heme oxygenases genes of A. alternata are essential for light response. The phenotype of the hemeoxygenase deletion strains of A. alternata resembles the fphA deletion strain. Hence the deletion strains were more resistant to oxidative stress compared to wildtype, but there was no effect on sporulation like in the fpha deletion strain. Coexpression of either one or both heme oxygenases with FphA proofed to be successful. The Expression of both heme oxygenases led to 10x more functional phytochrome compared to expression of only HoxA. HoxB alone was not sufficient to produce functional FphA. For HoxA a C-terminal anchor (CTA) like for mammalian heme oxygenases was identified. The CTA was deleted to enhance solubility in vitro. HoxA and HoxB were both able to bind heme in vitro, but only both were able to catalyze the reaction for the chromophor together in vitro. The chromophor synthesis pathway could be reconstituted in vitro after addition of FphA. Fusion of HoxA or HoxB to GFP revealed the localization at the mitochondria. In biochemical approach it could be further identified to be localization at the outer membrane of the mitochondria. They also form homo and hetero dimers and interact with FphA. These findings led to a new modell for the path of FphA in the cell. FphA is transcribed in the nucleus and translated at the ribosomes. Meanwhile heme is synthesized in the mitochondria. The blind FphA translocates to HoxA and HoxB interacting with both of them, while heme is transported out of the mitochondria to the heme oxygenases by heme binding proteins. HoxA and HoxB catalyze heme to biliverdin and help FphA to integrate the chromophor. The functional phytochrome leaves HoxA and HoxB. After FphA perceives red light, the signalcascade of HOG is activated, leading to activation of the transcription factor AtfA and the altering of expression of light regulated genes.
