PAT and automation strategies for the process development of PEGylated proteins

In der modernen Medizin werden vermehrt Medikamente eingesetzt die auf Molekülen mit hohem Molekulargewicht basieren die ihren Ursprung in biologischen Systemen haben. Diese biopharmazeutischen Medikamente werden unter anderem für verschiedene schwerwiegende und tödliche Erkrankungen eingesetzt. Darunter befinden sich verschiedene Formen von Krebs und chronische Erkrankungen wie Diabetes und Hämophilie die in der Regel lebenslange Medikation erfordern. Dies zeigt sich auch im Marktanteil dieser Medikamente. Acht der zehn meistverkauften Medikamente 2018 waren große biologische Moleküle wovon wiederum sechs monoklonale Antikörper (mAb) waren. ... mehrInsgesamt erzielten diese zehn Medikamente einen Umsatz von mehr als 80 Milliarden USD. [1] Diese relativ großen Moleküle wie Antikörper, Gerinnungsfaktoren oder Insulin können nicht sinnvoll auf traditionelle Art chemisch synthetisiert werden. Um dieses Problem zu umgehen, werden stattdessen biologische Systeme zur Produktion verwendet, um die natürliche Synthese zu imitieren. Dazu werden gentechnisch veränderte Bakterien oder Säugerzellen in großen Fermentern produziert um die Zielprodukte zu exprimieren. Als Nebeneffekt der Produktion in komplexen biologischen Systemen wie lebenden Zellen entsteht allerdings ein sehr komplexes Profil an Verunreinigungen die im sogenannten Downstream Processing (DSP) aus der geklärten Zellkulturflüssigkeit (HCCF) entfernt werden müssen. In Kombination mit der unabhängig davon arbeitsintensiven Identifikation von Kandidatenmolekülen und langwierige klinischen Studien als Voraussetzung zur Zulassung durch die Behörden sind dadurch sehr große finanzielle Investitionen notwendig um derartige Medikamente zu erforschen, entwickeln und zu produzieren.
Der DSP wird so entworfen, dass ungewünschte produktbezogene und prozessbezogene Verunreinigungen abgetrennt werden um eine konsistente Qualität, Wirksamkeit und geringe Nebenwirkungen des Produktes zu gewährleisten. Während einige potentielle Quellen für Prozessvarianz wie Temperatur, pH Wert und Pufferzusammensetzung relativ einfach zu kontrollieren sind, führt die Verwendung von lebenden Organismen in der Produktion immer zu variablen Ausgangsmaterialien im Aufreinigungsprozess. Der Aufreinigungsprozess besteht in der Regel aus einer Aneinanderreihung von Standardschritten wie Querstromfiltration (CFF), chemischen Reaktionen und Chromatographieschritten. Die Fähigkeit den Status des Prozesses zu bestimmen und den Prozess entsprechend zu steuern ist wichtig um die Variation im Ausgangsmaterial auffangen zu können. Regulierungsbehörden wie die Food and Drug Administration (FDA) und European Medicines Agency (EMA) bevorzugen solche wissensbasierten Ansätze für die Prozessentwicklung. Solche Prozesse folgen den Prinzipien von intrinsischer Produktqualität oder Quality by Design (QbD) und verwenden Prozessanalytische Technologien (PAT) um die kritischen Qualitätsattribute und kritischen Prozessparameter Critical Process Parameter (CPP) zu messen, um das Erreichen des gewünschten Produktprofils (QTPP) am Ende des Prozesses sicherzustellen. Dies trifft in besonderem Maße auf spezielle Formate von Proteinbasierten Medikamenten zu bei denen zusätzlich noch ein weiteres Molekül wie Polyethylenglykol (PEG) kovalent an das produzierte Protein gebunden wird nachdem es aufgereinigt wurde. Obwohl PEG selbst sich in biologischen Systemen relativ inert verhält kann es deutliche Vorteile haben ein therapeutisches Protein mit einem kovalent gebundenen PEG zu versehen. Der hydrodynamische Radius wird größer, die Ausscheidung durch die Niere wird verlangsamt und die Stabilität erhöht. Diese Vorteile stehen allerdings am Ende eines verkomplizierten Aufreinigungsprozesses. Nachdem das therapeutische Molekül produziert und aufgereinigt wurde wird die Konjugationsreaktion gefolgt von einer weiteren Reihe von Aufreinigungsschritten durchgeführt um das Protein mit der richtigen Anzahl konjugierter PEG Moleküle zu erhalten. Die Reaktion wird in der Regel in einem Rührkesselreaktor durchgeführt und es entstehen Proteine mit verschiedenen PEGylierungsgraden und Isoformen der jeweiligen Spezies.
Die Zielsetzung dieser Arbeit war es Fourier-Transform Infrared (FTIR) Spektroskopie als Prozessanalytische Technologie (PAT) und Automatisierungsstrategien für die Prozessentwicklung von PEGylierten Proteinen zu implementieren. Um FTIR Spektroskopie als PAT Methode verwendbar zu machen wurde zunächst ein experimenteller Aufbau entwickelt um direkt am Säulenausgang einer Chromatographieanlage Spektraldaten in Beinahe-Echtzeit als in-line Messung aufzunehmen. Dazu wurde das Spektrometer mithilfe einer speziellen Durchflusszelle in den Flussweg integriert und Software entwickelt, um die Messungen automatisiert zu starten. Neben MATLAB und OPUS-Skript basierter software wurde dazu ein externes Kommunikationsgerät von National Instruments verwendet um den Informationsaustausch mit der Chromatographieanlage zu ermöglichen. Zusätzlich wurden Methoden zur Korrektur der Spektraldaten aus Ionentauschchromatographieexperimenten untersucht. Da Wasser in solchen Experimenten in großen Konzentrationen vorliegt hat das aufgeben eines Salzgradienten einen signifikanten Einfluss auf das Spektrum. Obwohl die Salzkonzentration deutlich geringer ist als die des Wassers ist sie mehrere Größenordnungen höher als die der Analyte in Lösung. Als erste Implementierung zur Hintergrundkorrektur wurden Spektraldaten eines Blindlaufs abgezogen um den Einfluss der sich ändernden Salzkonzentration auszugleichen. Der experimentelle Aufbau für die Automatisierung der Reaktionsexperimente basierte ebenfalls auf einer Chromatographieanlage. Dabei wurden der Fraktionierer und die Probenaufgabepumpe mit 3D-gedruckten Adaptern versehen um die Reaktionslösung zu zirkulieren und die automatisierte Probennahme im Mikrotitermaßstab zu ermöglichen.
Nach der erfolgreichen Implementierung der FTIR Sepktroskopie als in-line Messung wurden mehrere Fallstudien durchgeführt. Die ersten beiden Studien basieren auf der Anwendung von Multivariater Datenanalyse (MVDA) in Kombination mit Spektraldaten. Lysozym und ein Monoklonaler Antikörper (mAb) wurden durch Gradientenelution auf einer Chromatographiesäule getrennt. Mithilfe der Spektraldaten und Offlineanalytik wurde ein PLS Regressionsmodell kalibriert um die Konzentration der beiden Spezies im Prozessstrom basierend auf den Spektraldaten abzuschätzen. Die zweite Fallstudie wurde nach demselben Prinzip durchgeführt. Lysozym wurde in einem Rührkesselreaktor mit PEG konjugiert und durch Ionentauschchromatographie aufgereinigt. Ebenfalls basierend auf einem PLS Regressionsmodell wurde die Konzentration der unterschiedlich PEGylierten Spezies am Säulenausgang abgeschätzt. In beiden Studien korrelierten die Modellantworten mit den Ergebnissen der Referenzanalytik und zeigten nur geringe Abweichungen. Die Grundidee hinter der ersten Fallstudie wurde schon in früheren Arbeiten umgesetzt wobei die zweite Studie speziell von FTIR profitiert, da PEG nicht UV-aktiv ist. Um die Vielseitigkeit von FTIR als PAT Methode zu zeigen wurde in einer weiteren Fallstudie die Konzentration einer Prozessbezogenen Verunreinigung in Form von Triton X-100 im Durchfluss während der Beladung einer Chromatographiesäule überwacht, indem eine lineare Regression auf die Spektraldaten angewendet wurde anstatt ein multivariates Regressionsmodell zu kalibrieren.
In thematischer Fortführung der zweiten Fallstudie wurde die integrierte Festphasen-PEGylierung und Aufreinigung durch dieselbe Chromatographiesäule mit FTIR ohne die Verwendung multivariater Regressionsmethoden mithilfe der Absorptionsspektren überwacht. Das zu PEGylierende Protein wurde auf der Säule gebunden und dann im gebundenen Zustand mit dem Konjugationsreagenz in Kontakt gebracht. Der PEGylierungsgrad der eluierenden Spezies wurde dann auf Basis des Verhältnisses der Extinktionskoeffizenten des Proteins und des PEG-Reagenz abgeschätzt. Dieses Vorgehen ist erheblich weniger arbeitsintensiv als das Durchführen der Experimente um ein Regressionsmodell zu kalibrieren. Des Weiteren wurde in dieser Studie ein vielseitigerer Ansatz zur Hintergrundkorrektur basierend auf Extended Multiplicative Signal Correction (EMSC) verwendet. Im Vergleich mit der Referenzanalytik konnte gezeigt werden, dass der PEGylierungsgrad mit vergleichsweise geringem Vorwissen abgeschätzt werden konnte. Der Aufwand um die Extinktionskoeffizienten zu bestimmen war dabei deutlich niedriger, als der experimentelle Aufwand um Regressionsmodelle wie in den vorhergehenden Studien zu kalibrieren.
Die PEGylierungsreaktion in Form eines Chargenprozesses wurde in einer weiteren Studie betrachtet. Die automatische Zirkulation der Prozesslösung durch das FTIR Spektrometer wurde in Kombination mit der automatisierten Probennahme in Mikrotiterplatten realisiert. Um dies zu erreichen wurde der Flusspfad einer Chromatographieanlage mit selbst entworfenen 3D-gedruckten Elementen verändert. Dabei wurde gezeigt, dass die mit verschiedenen Prozessbedingungen erzeugten Proben verwendet werden können um ein Kinetikmodell mit geringen Konfidenzintervallen zu kalibrieren. Des weiteren wurde untersucht inwieweit sich die Spektraldaten verwenden lassen um den Aktuellen Prozessfortschritt abzuschätzen.

Modern medicine keeps adopting an increasing amount of high molecular weight drugs like proteins that originate from biological systems. These biopharmaceutical drugs include therapies for several severe and fatal illnesses. Conditions targeted include multiple forms of cancer and conditions such as diabetes and hemophilia that usually require life-long medication. This is also reflected in the market share of such biopharmaceutical drugs. Out of the ten best selling pharmaceuticals in 2018, 8 are large biological molecules of which 6 are monoclonal antibodies (mAbs). Their combined sales exceeded 80 billion USD. ... mehr[1] Relatively large bio-molecules such as mAbs, clotting factors or insulin can not be chemically synthesized in a sensible way. Therefore these molecules are produced by biological systems that more closely resemble their native origins. Mammalian or bacterial cells are genetically modified to produce large quantities of the target molecule in a cell culture fermenter. As a side-effect of the production in living organisms, a complex impurity profile has to be removed during the so called Downstream Processing (DSP) after clarification of the Harvested Cell Culture Fluid (HCCF). In combination with tedious identification of drug candidates and extensive clinical trials to get them approved by regulatory bodies, large investments are necessary to research, develop and produce these kinds of drugs.
The DSP is designed to separate unwanted product-related and process-related impurities to ensure consistent quality, efficacy and minimal side effects of the produced drugs. While most potential sources of process variations like temperature, pH and buffer composition can be controlled very well, the use of living organisms always introduces variability into the starting material for the purification process. Common unit operations in DSP include Cross-Flow Filtration (CFF), batch reactions and chromatographic separations. The ability to determine the system state and control the process accordingly is important to handle the variability in the starting material. Regulatory bodies including the Food and Drug Administration (FDA) and European Medicines Agency (EMA) prefer knowledge based approaches for process design. In such a process following Quality by Design (QbD) principles, Process Analytical Technology (PAT) tools are utilized to measure Critical Quality Attributes (CQAs) and Critical Process Parameters (CPPs) to ensure the target Quality Target Product Profile (QTPP) will be met at the end of the process. This is especially true for very advanced protein based drugs where the parent protein is modified by covalently attaching Polyethylene Glycole (PEG) to it after production and purification. Despite the PEG molecule being relatively inert in biological systems there are clear benefits to attaching it to an existing protein drug. By being attached covalently, the hydrodynamic radius is increased, renal clearance is decreased and long term stability is improved among other benefits. Acquiring these benefits however comes at the price of a much more complicated production process. After the parent protein itself is produced and purified, the conjugation reaction itself takes place followed by a second set of purification steps to only produce the drug molecule with the right amount of PEG molecules attached to it. The reaction itself is generally run in batch mode and yields a complex mixture of proteins with different amounts of PEG attached as well as isoforms of each degree of PEGylation.
The aim of this thesis was to implement Fourier-Transform Infrared (FTIR) spectroscopy based PAT methods and automation strategies for the process development of PEGylated proteins. In order to utilize FTIR spectroscopy as a PAT tool a custom experimental setup was developed to enable near real time measurements of FTIR spectra in the effluent of a solid-liquid chromatography step. To this end, the spectrophotometer was integrated into the flow path of a lab scale chromatography system with a flow-through measurement accessory and custom software developed to trigger the measurements automatically. In addition to the MATLAB and OPUS-Script based software, additional communication hardware from National Instruments was utilized to facilitate the communication between MATLAB and the chromatography device. Additionally, the correction of spectral data recorded during ion exchange chromatography steps was evaluated. Water itself is very abundant in comparison to the target molecules, and even the salt used for gradient elutions is still multiple orders of magnitude more concentrated. Therefore water itself and changes in its absorbance caused by changing salt concentrations have to be accounted for to successfully extract information on the analytes from the spectral data. For the first implementation a full background run was subtracted from the data to account for changes in spectra caused by the rising salt concentration during elution. The automation setup for reaction monitoring was also based on hardware from a lab scale chromatography device. Specifically, the fraction collector and sample pump were re-purposed and fitted with 3D-printed adapters to circulate the reaction solution and automatically collect samples into micro titer plates for later analysis.
After the successful implementation of FTIR as an in-line sensor, multiple case studies were conducted to evaluate its capabilities. The first two case studies were based around Multivariate Data Analysis (MVDA) in combination with spectral data. Lysozyme and a monoclonal antibody (mAb) were loaded onto a chromatography column and separated by a salt gradient elution. A Partial-Least Squares (PLS) regression model was calibrated based on reference analytics and used to estimate the concentration of the two species from the spectral data. The second case study was performed in a similar manner. Lysozyme was conjugated with PEG in random batch PEGylation and then separated by ion-exchange chromatography. Utilizing a similar PLS regression model, the concentration of the individual species with a varying degree of PEGylation was estimated in the column effluent. In both cases, the estimated concentrations based on the calibrated PLS model correlated closely to the offline analytics for all tested conditions. The general idea behind the first case study has been implemented before, while the second case study is only feasible with FTIR because PEG is not active in UV. To showcase the versatility of FTIR, a process related impurity in the form of Triton X-100 was monitored in the flow-through of a chromatography step with a simple linear regression instead of a multivariate regression model.
To expand on the second case study, an integrated ion-exchange chromatography step after on-column PEGylation was monitored using FTIR spectroscopy without multivariate regression by directly extracting information from the absorbance spectra. The parent protein was loaded onto the column and the PEGylation reaction conducted in place. The degree of PEGylation was then estimated in the effluent based solely on the ratio of the extinction coefficients of the protein and the PEG reagent, eliminating the need for labor-intensive calibration of a regression model. A more versatile approach to background correction employing Extended Multiplicative Signal Correction (EMSC) was also applied in this study. In comparison to the offline analytics, it could be shown that the degree of PEGylation of the reacted protein eluting from the column could be estimated with little prior knowledge. The initial work needed to obtain the extinction coefficients was much lower than the previous method of performing multiple experiments and corresponding offline analytics to calibrate a PLS regression model.
The PEGylation reaction in batch mode was the focus of another study. Automatic circulation of the solution through the FTIR device was combined with automatic sampling into 96 well plates by modifying the flow path of an ÄKTApurifier System with custom 3D-printed adapter parts. It was shown that the automatically acquired samples from batches run with different conditions can be used to calibrate a kinetic reaction model with small confidence intervals. In addition, the possibility to utilize the spectral data recorded during the batch reaction to estimate the state of the reaction was also investigated.