Abstract:
Skelettmuskelregenerierung und Muskelwachstum sind zwei essentielle Aspekte der Muskelplastizität. Die Muskelregenerierung basiert auf dem komplexen und hoch konzertierten Prozess der Myogenese, der die Aktivierung der Muskelstammzellen, sogenannter Satellitenzellen, beinhaltet. Diese rufen proliferierende Vorläuferzellen hervor, die Myoblasten. Die Myoblasten verlassen den Zellzyklus und differenzieren zu gewidmeten Präkursoren, den Myozyten. Am Ende führt die Verschmelzung von mehreren Myozyten zur Bildung von Myofasern.
Im ersten Teil meiner Doktorarbeit habe ich die Rolle des transkriptionellen Co- regulators nTRIP6 bei der Regulierung der Myogenese untersucht. ... mehrFrühere in vitro Arbeiten legen nahe, dass nTRIP6 eine Rolle bei der Myogenese, genauer am Übergang zwischen Proliferation und Differenzierung, spielen könnte. In einem in vitro Model der Myogenese mit der C2C12-Maus-Myoblasten-Zelllinie konnte ich zeigen, dass selektives Blockieren der nTRIP6-Funktion eine beschleunigte Expression der frühen Differenzierungsmarker hervorrief, ohne dabei die Dynamik der Zellzyklus- Terminierung zu verändern. Diese vorzeitige frühe Differenzierung führte zu einer Verzögerung der Expression von späten Differenzierungsmarkern und der Verschmelzung der Myozyten. Somit verhindert nTRIP6 die vorzeitige Differenzierung der Myoblasten und ermöglicht in den späteren Stadien die korrekte Differenzierung und Verschmelzung der Myozyten. Dementsprechend führt ein Gen-Knockout des TRIP6-Gens in den Satellitenzellen von Mäusen zu deregulierten Skelettmuskelregenerationsdynamiken. Als Indikator für die Verschmelzung wurde eine erhöhte Anzahl an Myozyten sowie eine Verzögerung bei der Erhöhung des Myofaser-Durchmessers verwendet. Folglich trägt nTRIP6 Expression zur zeitlichen Kontrolle der Myogenese und der Skelettmuskelregeneration bei.
Im zweiten Teil dieser Arbeit habe ich die Regulierung der Myofaser-Größe untersucht. Der Hauptinduktor der Muskelhypertrophie, die hauptsächlich auf der Vergrößerung der Myofaser basiert, ist der mTORC1-(mechanistic target of rapamycin complex 1) Signalweg. Der Upstream-Aktivator von mTORC1 ist das kleine G-Protein RHEB, das der Lysosomen-Membran zugeordnet und dabei farnesylierungsabhängig ist. RHEB wurde bereits im Zellkern gefunden, jedoch ist die nukleare Funktion von RHEB, insbesondere im Zusammenhang mit dem Muskelwachstum, noch nicht erforscht. Mit Zebrafischen als in vivo Model konnte ich zeigen, dass RHEB in Myofasern adulter Fische vor allem zytosolisch ist. Im Gegensatz dazu befindet sich RHEB in Myofasern von Embryos ausschließlich im Nukleus. Nukleares RHEB könnte somit eine Besonderheit von schnell wachsenden Muskeln sein. Des Weiteren konnte in vitro gezeigt werden, dass in Zellen, in denen RHEB sowohl zytosolisch als auch nuklear vorkommt, die Verwendung eines Farnesylierungstransferase-Inhibitors die nukleare Lokalisation von RHEB erhöht. Dies deutet darauf hin, dass ein wesentlicher Faktor der nuklearen Anreicherung von RHEB ein Mangel an Farnesylierung ist. Darüber hinaus förderte eine konstitutive aktive Mutante von RHEB, welche nur im Zellkern vorhanden war, eine Vergrößerung der Myofaser in Zebrafisch-Embryonen, während eine dominant negative Mutante Atrophie verursachte. Erstaunlicherweise hemmte weder die Verwendung einer RHEB-Mutante mit reduzierter mTORC1- Interaktion, noch die Verwendung eines mTORC1-Inhibitors, die Fähigkeit der konstitutiven aktiven RHEB Mutante, zur Vergrößerung der Myofaser. Somit fördert nukleares RHEB das Myofaser-Wachstum mTORC1-unabhängig. Schließlich konnte ich durch in vitro Experimenten zeigen, dass nukleares RHEB die Transkription von ribosomaler RNA - einer essenziellen Voraussetzung des Myofaser Wachstums - bei Zebrafischen fördert. Dieser Teil meiner Arbeit identifizierte eine nukleare Funktion von RHEB bei der Kontrolle des Muskelwachstums über einen mTORC1- unabhängigen Mechanismus. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Vielfalt und Komplexität der Mechanismen, die an der Regulierung der Skelettmuskelplastizität beteiligt sind.
Abstract (englisch):
Skeletal muscle regeneration and muscle growth are two essential aspects of skeletal muscle plasticity. Muscle regeneration relies on the highly orchestrated process of myogenesis, which involves the activation of muscle stem cells, the so-called satellite cells. These cells then give rise to proliferating progenitors, the myoblasts, which subsequently exit the cell cycle and differentiate into committed precursors, the myocytes. Ultimately, the fusion of myocytes leads to myofibre formation. In the first part of my thesis, I investigated the role of the transcriptional co-regulator nTRIP6, the nuclear isoform of the LIM-domain protein TRIP6, in the regulation of myogenesis. ... mehrPrevious work in vitro suggested that nTRIP6 may play a role in myogenesis at the transition between proliferation and differentiation. In an in vitro model of myogenesis using the C2C12 mouse myoblast cell line, I showed that selectively blocking nTRIP6 function results in accelerated expression of early differentiation marker genes without modifying the dynamics of cell cycle exit. This premature early differentiation was associated with delays in the expression of late differentiation marker genes and in myocyte fusion. Thus, nTRIP6 prevents premature myoblast differentiation, allowing proper myocyte differentiation and fusion at later stages. Accordingly, knocking out the Trip6 gene in satellite cells in the mouse leads to deregulated skeletal muscle regeneration dynamics, with increased numbers of myocytes and a delay in the increase in myofibre diameter, used as an index of fusion. Thus, nTRIP6 expression contributes to the temporal control of myogenesis and of skeletal muscle regeneration.
In the second part of this work, I investigated the regulation of myofibre size. The main inducer of muscle hypertrophy, which primarily relies on increases in myofibre size, is the mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1) pathway. The immediate upstream activator of mTORC1 is the small G-protein RHEB, which is associated to
lysosomal membranes in a farnesylation-dependent manner. RHEB has also been found in the nucleus, however its nuclear functions have not been investigated, in particular in the context of muscle growth. Using the zebrafish as an in vivo model, I showed that RHEB is mostly cytosolic in myofibres from adult fish. In contrast, RHEB
was nearly exclusively nuclear in myofibres from embryos. Thus, nuclear RHEB might be a feature of fast-growing muscles. Furthermore, in vitro in cells where RHEB is both cytosolic and nuclear, a farnesyl transferase inhibitor increased the nuclear localisation of RHEB, suggesting that the lack of farnesylation is a major determinant of RHEB nuclear accumulation. In addition, a nuclear-targeted, constitutively active mutant of RHEB promoted an increase in myofibre size in zebrafish embryo, while a nuclear-targeted dominant negative mutant induced atrophy. Surprisingly, a mutation that reduces RHEB interaction with mTORC1, as well as treatment with an mTORC1 inhibitor did not hamper the ability of the constitutive active RHEB mutant to increase myofibre size. Thus, nuclear RHEB promotes myofibre growth in an mTORC1-independent manner. Finally, in vitro experiments showed that nuclear RHEB stimulated zebrafish ribosomal RNA transcription, which is an essential requirement for myofibre growth. Thus, this part of my work uncovered a nuclear function for RHEB in the control of muscle growth via an mTORC1-independent mechanism. Together, the data presented in this thesis illustrate the diversity and complexity of the molecular mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle plasticity.
