Generierung einer PARP1-Knockout Zelllinie zur Charakterisierung der Rolle von PARP1 in der DNA-Schadensantwort

Die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1) spielt eine multifunktionale Rolle in der DNA-Schadensantwort (DDR) und gilt als Schlüsselprotein für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Nach Exposition mit ionisierender Strahlung (IR) wurde bereits gezeigt, dass PARP1 mit mehreren zentralen Signalproteinen der DDR interagiert und einen direkten Einfluss auf die p53-vermittelte Schadensreaktion zu nehmen scheint. Die Reichweite der PARP1-vermittelten Antwort, und inwieweit die Interaktionen grundlegend für die Schadensantwort sind, sind jedoch noch nicht geklärt. ... mehrDiese Arbeit soll dazu beitragen, die multifunktionale Rolle von PARP1 im Signalnetzwerk der DDR besser einordnen zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels CRISPR/Cas9 eine U2OS-basierte PARP1-Knockout Zelllinie generiert, die anschließend dazu diente, die Rolle von PARP1 in der DDR zu untersuchen. Durchgeführt wurden Vergleichsuntersuchungen der U2OS Wildtyp Zelllinie und der U2OS PARP1-Knockout Zelllinie unter basalen Bedingungen sowie unter Einfluss verschiedener Schadensarten. Genexpressionsanalysen sowie die Analyse der Zellzyklusverteilung nach Behandlung mit ionisierender Strahlung offenbarten deutliche Unterschiede in der DNA-Schadensantwort, die eine neue potenzielle Verbindung zwischen den Signalwegen von dem Sensorprotein PARP1, dem Transducer-Protein ATM und p53, einer der wichtigsten Effektorproteine in der DDR, aufzeigte. Es konnte ferner gezeigt werden, dass PARP1 einen größeren Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität von p53 hat als bisher angenommen. Der Grund hierfür lässt sich auf Signalwege upstream von p53 zurückführen, die sich unter anderem auf die Interaktion von PARP1 mit ATM zurückführen lassen. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass eine fehlende Funktion von PARP1 einen permanenten G2-Arrest nach Schadensinduktion verursacht und den Zelltod der geschädigten Zellen maßgeblich beeinträchtigt. Letzteres lässt sich ebenfalls auf die durch PARP1 vermittelte p53-Aktivität zurückführen und darüber hinaus vermutlich auf den PARP1-abhängigen Zelltodmechanismus Parthanatos. Das Zusammenwirken von PARP1 und ATM scheint wesentlich beim Ablauf der DDR nach IR zu sein und beeinflusst hierbei die p53-abhängige Schadensantwort auf unterschiedlichen Ebenen. PARP1 spielt folglich eine wesentliche Rolle für eine funktionierende Schadensantwort nach ionisierender Strahlung. Der Einfluss von PARP1 auf ATM konnte in dieser Arbeit jedoch nicht auf funktioneller Ebene spezifiziert werden, sodass weitere Studien erforderlich sind, um die Interaktion von PARP1 und ATM im Kontext der DDR zu verifizieren.

Poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) plays a multifunctional role in the DNA damage response (DDR) and is considered a key protein for the maintenance of genomic stability. After exposure to ionizing radiation (IR), PARP1 has previously been shown to interact with several essential signaling proteins of the DDR and appears to impact the p53-mediated damage response directly. However, the extent of the PARP1-mediated response and whether or not the interactions are fundamental to the damage response have not yet been elucidated. This work will help to understand better the multifunctional role of PARP1 in the signaling network of the DDR. ... mehrIn this work, a U2OS-based PARP1 knockout cell line was generated using CRISPR/Cas9, which was then used to investigate the role of PARP1 in the DNA damage response. Comparative studies of the U2OS wild-type cell line and the U2OS PARP1 knockout cell line were performed under basal conditions and after induction of different damage types. Gene expression analysis, as well as cell cycle distribution analysis after treatment with ionizing radiation, revealed significant differences in DNA damage response, pointing towards a new potential link between the signaling pathways of the sensor protein PARP1, the transducer protein ATM and p53, one of the major effector proteins in the DDR. It was further shown that PARP1 has a greater impact on the transcriptional activity of p53 than previously thought. The reason for this can be traced back to signaling pathways upstream of p53, which can be attributed, among other things, to the interaction of PARP1 with ATM. Furthermore, lack of function of PARP1 was found to cause permanent G2-arrest after damage induction and to affect cell death of damaged cells. The latter can also be attributed to PARP1-mediated p53 activity and, in addition, to the PARP1-dependent cell death mechanism parthanatos. The synergism of PARP1 and ATM appears to be essential in the progression of the DDR after IR, thereby influencing the p53-dependent damage response at different levels. PARP1 consequently plays an essential role in a functional DNA damage response after ionizing radiation. However, the impact of PARP1 on ATM could not be specified at the functional level in this work, and further studies are needed to verify the interaction of PARP1 and ATM in the context of DDR.