Peptide Nucleic Acids (PNA) as a versatile tool for modulation of biological systems with visible light

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Kombination neuartiger photoschaltbarer Moleküle, die möglicherweise im Bereich des sichtbaren Lichts operieren, mit PNA (Peptidonukleinsäuren) - künstlichen Oligonukleotidanaloga mit hoher Hybridisierungsaffinität und Sequenzselektivität gegenüber komplementären DNA- und RNA-Strängen. Die Bindung ist so stark, dass unter optimalen Bedingungen Genexpressionen (Antigene) und Übersetzungen in Proteine (Antisense) in vivo verhindert werden können. Aufgrund einer hochspezifischen Hybridisierung mit einem Oligomer von >10 Nukleobasen können kurze PNA-Oligomere selektiv auf bestimmte Ziele innerhalb lebender Zellen oder Organismen abzielen, ohne die übrige biosynthetische Maschiner ie der Zelle zu stören. ... mehrDas langfristige Ziel dieser Arbeit war die Implementierung photoschaltbarer Einheiten, wie das Azobenzol oder ein Spiropyran, um ein reversibles Schalten des Antigens oder des Antisense- Effekts mit sichtbarem Licht zu erreichen.
In einem Nachfolgeprojekt wurde die PNA für Untersuchungen gegen das HIV (humanes Immunschwächevirus) eingesetzt. HIV verursacht AIDS, eine der derzeit anspruchsvollsten Krankheiten. Das Virus selbst greift das Immunsystem an und vernichtet es systematisch. Da das Virus unsere DNA benutzt, um sich zu reproduzieren, wird es nicht als "Eindringling" erkannt. Es breitet sich leicht aus, und eine kommerziell verfügbare Heilung ist noch nicht bekannt, obwohl kürzlich eingeführte antiretrovirale Therapien die Virusmenge vorübergehend unter die Nachweisgrenze senken können. Die derzeitige Hypothese ist, dass das Virus irgendwo im Organismus konserviert wird, wo es von den üblichen Medikamenten nicht erreicht werden kann. Da es Fluoreszenzfarbstoffe gibt, die eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität (einen Aufhellungseffekt) zeigen, während sie innerhalb eines Doppel-Oligonukleotidstra ngs (RNA/RNA; RNA/DNA; DNA/DNA; PNA/DNA; PNA/RNA) hybridisiert sind, haben wir versucht, ein analytisches Werkzeug zum Nachweis von HIV-RNA zu konstruieren. Die fluoreszierende Lokalisierung der HI-Viren würde wiederum dazu beitragen, Medikamente zu entwickeln, die die letzten Reservoire des Virus erreichen und es effizient aus dem Organismus ausrotten können. Die Region der HIV-RNA, auf die wir mit PNA-Sequenzen abzielen wollen, ist bekanntlich die wichtigste Region für die Vermehrung. Eine Blockierung dieser Region mit einer komplementären PNA würde verhindern, dass sie die richtige Faltung annimmt. Dies würde zu einem Knockdown führen, was die weitere Ausbreitung des Virus behindern würde. Eine andere Strategie bestand darin, das Ende der PNA-Sequenzen mit einer chemischen Ribonuklease zu dekorieren. Ein solches PNA-Oligomer würde die komplementäre RNA sequenzspezifisch ausschneiden und so die RNA des Virus und damit das Virus selbst zerstören.

The main goal of this thesis was to combine novel photoswitchable molecules, possibly operational in the visible light range, with PNA (peptidonucleic acids) – artificial oligonucleotideanalo gues with high hybridisation affinity and sequence selectivity towards complementary DNA and RNA strands. The binding is so strong, that under optimal conditions gene expressions (antigene) and translations into proteins (antisense) can be prevented in vivo. Due to a highly specific hybridisa t ion with an oligomer of >10 nucleobases, short PNA oligomers can selectively target particular targets inside living cells or organisms without interfering with the rest of cel ’s biosynthetic machiner y. ... mehrThe long-term goal of this work was implementation of photoswitchable units, like the azobenzene or a spiropyrane, to achieve reversible switching of the antigen or antisense effect with visible light.
In an offspring project,the PNA was implemented for investigations against the HIV (human immunodeficiency virus). HIV causes AIDS, which is currently one of the most demanding diseases. The virus itself attacks the immune system and systematically destroys it. Since the virus uses our DNA to reproduce itself it is not recognized as an ´invader`. It spreads easily and a commercially available cure is not known yet, although recently introduced antiretroviral therapies can temporarily reduce the virus’ level under detection limits. The current hypothesis is that the virus is preserved somewhere in the organism, where the common drugs cannot reach it. Since there are fluorescent dyes which exhibit an increase of the fluorescence intensity (a light-up effect) while hybridized inside of a double oligonucleotide strand (RNA/RNA; RNA/DNA; DNA/DNA; PNA/DNA; PNA/RNA) we attempted to construct an analytical tool to detect HIV-RNA. Fluorescent localization of the HI viruses would, in turn, help to design drugs that can reach the last reservoirs of the virus, and efficiently eradicate it from the organism. The region of the HIV RNA, which we want to target with PNA sequences, is known of to be the most important region for multiplying. Blocking this region with a complementary PNA would prevent it from assuming the correct fold. This would lead to a knockdown, which hinder the virus to spread further. Another strategy was to decorate the end of the PNA sequences with a chemical ribonuclease. Such a PNA oligomer wouldcut the complementary RNA in a sequence-specific manner, thus destroying the RNA of the virus and herby the virus itself.