Differentiation and Cultivation of Retinal Cells in a Defined 3D Environment = Differenzierung und Kultivierung von retinalen Zellen in einer definierten 3D-Umgebung

Unter den fünf Sinnesempfindungen nimmt das Sehen für die meisten Säugetiere
die zentralste Rolle ein. Das Sehvermögen wird durch die Retina bewerkstelligt,
einem geschichteten neurosensorischen Gewebe das den Augapfel auskleidet. Die
Retina besteht aus Müller Gliazellen und sechs neuronalen Zelltypen und ist in
das retinale Pigmentepithel eingebettet. Licht wird durch die Photorezeptoren
detektiert, von Interneuronen verarbeitet und über die Ganglienzellen an das
Gehirn weitergeleitet.
Seit Jahrzehnten werden für die Wissenschaft Tiermodelle verwendet, allerdings
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können diese nicht alle Aspekte der Entwicklung und Erscheinungsbilder von
Erkrankungen widerspiegeln. Vor kurzem wurde ein in vitro Kultivierungssystem
eingeführt, das als Organoide bezeichnet wird. Pluripotente Mausstammzellen
wurden aggregiert und in der Gegenwart von Extrazellulärer Matrix weiter kultiviert.
Dies führt zur Differenzierung von freischwimmendem Gewebe, das einer
Retina ähnelt. Während Organoide unzählige Möglichkeiten für die Wissenschaft
bieten, gehen sie auch mit einigen Beschränkungen einher: sie weisen nicht das
retinale Pigmentepithel auf, sind von der Entwicklung auf frühe postnatale Stadien
limitiert und ihre Kultivierungszeit ist auf ca. 30 Tage beschränkt.
In dieser Arbeit wurden Anstrengungen vorgenommen, die Beschränkungen
des Organoid-Systems auszugleichen und zu verbessern. Dies sollte durch die
Kombination mit mikro-3D gedruckten Substraten bewerkstelligt werden, um so
ein komplexeres in vitro Kultivierungssystem zu erlangen. Zur Herstellung der
Strukturen wurde die etablierte Methode des Direkten Laserschreibens verwendet.
Diese Methode eignet sich hervorragend, um großflächige Substrate mit einer
Genauigkeit jenseits der Mikrometer-Grenze, herzustellen.
Die Differenzierung und Kultivierung von retinalen Organoiden wurde etabliert
und durch Modifikationen des ursprünglich publizierten Protokolls verbessert.
Dadurch konnte die retinale Induktion in Organoiden signifikant verbessert werden.
Die dreidimensionalen Substrate bestehen aus Säulenfeldern mit einer Höhe
von 70 μm, einem Radius von 3.5 μm und einem Kanten-zu-Kanten Abstand von
jeweils 20 μm. Ferner können diese Strukturen durch Proteinbeschichtungen
weiter modifiziert werden, wodurch Zellen eine angemessene Wachstumsumgebung
geboten wird.
In einem weiteren Schritt wurden retinale Organoide enzymatisch und mechanisch
zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert und auf Laminin-beschichteten 3D
Substraten ausgesät. Von Organoiden abstammendes Gewebe in 3D Substraten
wurde auf die Viabilität, die Zusammensetzung der Zelltypen und die Organisation
der Zellen überprüft. Die 3D Substrate zeigten keinen negativen Einfluss auf
die Viabilität der Zellen und alle Hauptklassen an retinalen Zellen waren vorhanden.
In einigen Fällen konnte eine bevorzugte Orientierung in axialer Richtung
beobachtet werden. Photorezeptor-ähnliche Zellen lokalisierten bevorzugt in den
oberen Bereichen der Substrate. Außerdem konnte die Kultivierungszeit innerhalb
der Strukturen auf bis zu 50 Tage ausgeweitet werden.
In dieser Dissertation wurde ein in vitro Kultivierungssystem erfolgreich eingeführt.
Zur Verbesserung der Langzeitkultivierung wurden durch Direktes Laserschreiben
hergestellte 3D Substrate mit von retinalen Organoiden abstammende
Zellen kombiniert. In nachfolgenden Arbeiten kann das System weiter analysiert
und Modifikationen vorgenommen werden.

Of the five senses, vision is probably of prime importance for most mammals.
Central to visual perception is the retina, a stratified neurosensory tissue lining the
back of the eye. It comprises one glial and six neural cell types and is embedded
in the retinal pigment epithelium. Light is detected by photoreceptors, modulated
by interneurons and forwarded to the brain via ganglion cells.
For decades, research was conducted on animal models, however, not all aspects
of development and disease can be approximated therein. Recently, an in vitro
cultivation system termed organoids was established. ... mehrMouse pluripotent stem
cells have been aggregated and cultivated in the presence of extracellular matrix,
leading to the differentiation of free-floating retina-like tissues. While organoids
offer immense opportunities for research, they also have inherent limitations: they
lack the retinal pigment epithelium cells, are developmentally restricted to stages
comparable to early postnatal development, and their cultivation time is limited
to approximately 30 days.
In this work, we sought to address these limitations and improve the organoid
system. This should be achieved by a more complex in vitro cultivation system via
the combination of retinal cells with micro-3D printed substrates. The established
method of direct laser writing was employed to fabricate these 3D scaffolds. This
method excels at generating larger-scaled substrates with an accuracy within the
sub-micron range.
The differentiation and cultivation of retinal organoids was established and
further improved by implementing modifications to published protocols. By this
a significant increase in the efficiency of retinal induction was achieved.
Three-dimensional substrates consisting of pillar arrays with a height of 70 μm
and a radius of 3.5 μm, distanced 20 μm from edge to edge were designed. These
substrates were permissive to modifications via protein coating, thereby offering a
suitable growth environment for cells.
In a next step, retinal organoids were enzymatically and mechanically dissociated
to a single cell suspension and seeded on laminin-coated 3D substrates.
Organoid-derived retinal tissues cultivated in 3D substrates were analysed for
their viability, cellular composition and organization. The 3D substrates had no
adverse effect on the viability and all major retinal cell types were present.
In some cases, a preferential organization in axial direction was observed with
photoreceptor-like cells preferentially localizing to the upper part of the substrates.
Furthermore, the cultivation time in the 3D substrates was prolonged to up to 50
days.
In this thesis, a long-term in vitro cultivation system combining retinal organoidderived
cells and direct laser writing-fabricated 3D substrates was successfully
established. In successive work, further analyses and modifications of the system
could be performed.