Abstract:
Das Hochdurchsatz-Screening ist von großer Bedeutung und bildet einen der Eckpfeiler der aktuellen Life-Science-Research wie Biologie, Biotechnologie, Biochemie, Computerwissenschaft, medizinische Chemie und Pharmakologie. Das Interesse an einem Screening mit hohem Durchsatz unter akademischen, mittleren und kleinen Biotech-Unternehmen, staatlichen und gemeinnützigen Screening-Standorten, sowie Auftragsforschungsorganisationen wurde spürbar erhöht, da Hochdurchsatz-Screenings eine effiziente Analyse von einer Vielzahl von Stoffen in kürzester Zeit ermöglicht. Das steigende Interesse an dieser Methode führte zu einer schnellen Entwicklung von Screening-Technologien mit hohem Durchsatz in Kombination mit komplementären Technologien. ... mehrDie Nachteile herkömmlicher Hochdurchsatz-Screenings beinhalten hohe Kosten und Materialverschwendung, lange Zykluszeiten, geringe Produktivität und die begrenzte Ausbaufähigkeit der existierenden Stoffbibliotheken. Die genannten Nachteile verdeutlichen die Wichtigkeit der Bemühungen zur Entwicklung von verbesserten miniaturisierten und automatisierten Hochdurchsatz-Screening Methoden. Droplet Microarray (DMA) ist eine dieser miniaturisierten Plattformen, welche durch die Vereinigung von Oberflächenchemie, Oberflächenfunktionalisierung und Biologie erschaffen wurde. Die hohe Tröpfchendichte auf DMA senkt die Kosten, Materialverschwendung, Zykluszeit des Screenings und erhöht die Effizienz des Verfahrens, während sie effektiv die Verwendung größerer chemischer und biologischer Bibliotheken unterstützt. Die weitere Entwicklung, Auswertung und Verbesserung der DMAs spielt nicht nur für den Fortschritt der Hochdurchsatz-Screenings eine wichtige Rolle, sondern beherbergt auch unermessliches Potential in pharmalogischen Bereichen und der Stammzellenforschung, in welcher es die Wirksamkeit von Gentransfers und das Kultivieren von undifferenzierten Stammzellen erleichtert.
Pharmakologisches Priming (Drug Repurposing) wurde als adjuvante Strategie zur Verbesserung der Effizienz nicht-viraler Genübertragung angesehen. Dennoch ist die facettenreiche Anwendung des pharmakologischen Priming aufgrund der unerschwinglich hohen Kosten für Reagenzien und die Durchführung der Methode unweit verbreitet, was den aufkommenden Drang nach miniaturisierten Plattformen und Drug Repurposing erklärt. Abgesehen von der Dringlichkeit im pharmakologischen Bereich, um klinisches Potenzial zu realisieren, benötigt die Stammzellenforschung auch miniaturisierte Methoden um den Einfluss von Zelloberflächeninteraktionen und Zellkulturmedium auf das Verhalten von Stammzellen und die Effekte von Zusatzstoffen, und Oberflächenbeschichtungen einschließlich oberflächenabsorbierter Proteine auf Stammzellen zu beobachten.
Das Ziel für den ersten Teil der Dissertation war es nach kleinen Molekülen (Stoffen) auf DMAs zu suchen, welche transfektionsverstärkende Effekte beinhalten, um eine mögliche Verbesserung in den Bereichen Gentransfer- und Therapie zu bieten. Eine Untersuchung der Einflüsse von 774 Food and Drug Administration (FDA)-zugelassenen Wirkstoffen auf die Transfektionseffizienz mit verschiedenen Zelltypen in miniaturisierter- und hochdurchsatzweise wurde mit Hilfe der DMAs veranlasst. Das Screening der FDA-zugelassenen Arzneimittelbibliothek identifizierte 14 einzelne Verbindungen, die eine zwei- bis fünffache Verbesserung der Transfektion aufwiesen. Diese Treffer wurden verifiziert und in großem Maßstab untersucht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der auf DMA basierende Ansatz für das Drug Repurposing beständig ist und zur Untersuchung und Entwicklung wirksamerer nicht-viraler Genübertragungssysteme verwendet werden könnte.
Das Ziel des zweiten Abschnitts der Dissertation war es, den Einfluss von Oberflächeneigenschaften und sinkendem Volumen auf die Pluripotenz von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu bestimmen. Zwei künstliche Oberflächen mit unterschiedlichen chemischen Elementen und deren dazugehörigen DMAs wurden für die Kultivierung und Pluripotenz von hiPSCs in vitro untersucht. Die Oberflächen und DMAs wurden genutzt, um human induzierten pluripotenten Stammzellen in 2 ml und 200 nL-Volumen zu kultivieren. Die Ergebnisse zeigten, dass hiPSCs eine hohe Lebensfähigkeit, sowie die erwartete Morphologie und Pluripotenz in 200 nL Tröpfchen auf Typ A und Typ B DMAs ohne Matrigelbeschichtung nach 24 h Kultivierung aufwiesen. Dies beweist, dass DMAs eine vielseitige und simple Plattform für kurzzeitige und xeno-freie Hochdurchsatz-Screenings von hiPSCs sind.
Als Ziel für den dritten Teil der Dissertation wurde das Identifizieren von chemisch definierten Proteinen, welche das Kultivieren und Aufrechterhalten der Plutipotenz von hiPSCs Zellen auf DMAs, sowie Mikrotiterplatten weiter verbessern könnten, angesetzt. Es ist möglich eine Proteinbeschichtung, Zellkultur und Immunfluoreszenzfärbung auf miniaturisierter Ebene parallel mit Hilfe von DMAs durchzuführen, was zu einer Reduzierung von Versuchsfehlern und Verbrauchsmaterialien führt. Auf Grund dessen wurden DMAs als Basis zur Überprüfung von elf verschiedenen Proteinen und deren verwandten binären und ternären Kombinationen (insgesamt 231 verschiedene Gruppen) auf ihre Fähigkeit zur Erhaltung der Pluripotenz von hiPSCs genutzt. Aus diesem Raster wurden zehn Gruppen von ternären Proteinkombinationen identifiziert, welche die Proliferation und das Self-Renewal besser unterstützen könnten als mit Matrigel beschichtete Oberflächen. Die effizientesten Proteinkombinationen des primären Screenings wurden weiterhin in einer Langzeitkultur (fünf Wochen) verifiziert. Zusätzlich wurde die Formation von embryonalen Körperchen der auf den ausgewählten Proteinbeschichtungen kultivierten Zellen erzielt und es folgte die Differenzierung der hiPSCs in drei Keimblätter.
Zusammengefasst, wurden DMAs als miniaturisierte Schnellscreening-Plattform verwendet, um mehrere biologische Fragen zu beantworten. Als erstes wurden 776 Wirkstoffe auf Nanoebene untersucht und somit kosten-, zeit- und arbeitssparend verwertet. Vierzehn Stoffe wiesen eine zwei- bis fünffache Verbesserung der Transfektionstechniken auf. Als zweites wurden chemische Komponente von Zellkulturoberflächen und kleinen Volumina (200nl) von Zellkulturmedium gefunden, die zur Erhaltung der Pluripotenz von hiPSCs beitragen. Als letztes wurden zehn Gruppen von ternären Proteinkombinationen identifiziert, welche das Kultivieren von undifferenzierten hiPSCs unterstützen. Zwei von ihnen wurden weiter untersucht, um eine Langzeitkultur von undifferenzierten hiPSCs zu erzielen, gefolgt von ihrer Differenzierung in drei Keimblätter. Eine Zusammenfassung und eine Aussicht auf die Zukunft befinden sich am Ende der Dissertation.
Abstract (englisch):
High-throughput screenings are of momentous importance and have been one of the cornerstones of current life science research, such as biology, biotechnology, biochemistry, computational science, medical chemistry, and pharmacology. Interests in high-throughput screenings among academia, medium and small biotech companies, governmental, and not-for-profit screening sites as well as contract research organizations dramatically increased because high-throughput screenings enable efficient analysis of large numbers of compounds in a short time. The increasing interests result in the rapid development of high-throughput screening technologies in combination with complementary technologies. ... mehrThe conventional high-throughput screenings have disadvantages including high costs, high waste, long cycle time, low productivity, and limited expandability to larger libraries. These disadvantages underline the importance of efforts towards the development of miniaturized and automated high-throughput screenings technologies. Droplet microarray is one of the miniaturized techniques which is developed by combining surface science, surface functionalization and biology. The high density of droplets on droplet microarray slides decreases the costs, waste, cycle time of the screening and increases the productivity and applicability to high-throughput screenings of larger chemical and biological libraries. Further development, evaluation, and improvement of the droplet microarray platform not only play an important role in progress of high-throughput screenings, but also hold tremendous potential in pharmacological research and stem cell research such as increasing gene delivery efficiency and facilitating undifferentiated stem cell culture.
Pharmacological priming (drug repurposing) has been regarded as an adjuvant strategy to improve non-viral gene delivery efficiency. Nevertheless, the broad applicability of pharmacological priming has not been well established due to the prohibitively high costs of reagents and operation, which explains the urge of miniaturized platform and drug repurposing approach. In addition to the urgent requirement in pharmacological field, in order to realize clinical potential, stem cell research also requires miniaturized techniques to investigate the influence of cell-surface interactions and small cell culture medium on stem cell behavior and the effects of additives, surface coatings, including surface adsorbed proteins on stem cell fate.
The goal for the first section of the dissertation was to search for small molecules (compounds) which hold transfection enhancing effect using droplet microarray platform, which could help in gene delivery and gene therapy research. An investigation of the influence of 774 Food and Drug Administration‐approved drugs on transfection efficiency with different cell types in a miniaturized and high-throughput manner was performed using the droplet microarray platform. The screening of the library identified fourteen individual compounds that presented approximately 2-5-fold transfection efficiency enhancement. These hit compounds were then verified and studied at larger scale. The results indicate that the high-throughput and drug repurposing approach based on droplet microarray platform is robust and can be used to study and develop more effective non-viral gene delivery systems.
The goal for the second section of the dissertation was to evaluate the effect of surface properties and small volumes on pluripotency of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) utilizing the droplet microarray platform. Two artificial surfaces contained different chemical elements and their corresponding droplet microarray slides were investigated for cultivation and pluripotency of hiPSCs in vitro. The surfaces and droplet microarray slides were used to culture human induced pluripotent stem cells in 2 mL and 200 nL volumes. The results showed that hiPSCs exhibited high viability, expected morphology and pluripotency in 200 nL droplets on both type A and type B droplet microarray slides without Matrigel coating for 24 h of culture. This makes droplet microarrays a versatile and simple platform for short-term and xeno-free high-throughput screening of hiPSCs.
The goal for the third section of the dissertation was to identify chemically defined proteins which could further improve hiPSCs culture and maintain pluripotency of stem cells using droplet microarray platform and also in standard microtiter plates. It is feasible to do protein coating, cell cultivation and immunofluorescence staining in a miniaturized and parallel manner on droplet microarray slides, resulting in reduction of consumables and experimental error. Thus, droplet microarray platform was used to screen eleven proteins and their related binary and ternary combinations (in total 231 diverse groups) for their capability of maintaining pluripotency of hiPSCs. Ten groups of ternary protein combinations were identified, which could support self-renewal and proliferation of hiPSCs better than on Matrigel-coated surfaces. The most effective protein combinations from the primary screening were further validated in long-term (five weeks) culture. Additionally, embryoid body formation from the hiPSCs cultured on selected protein coatings, followed by differentiation into three germ layers was achieved.
In summary, droplet microarray platform was utilized as a miniaturized and rapid screening platform to answer several biological questions. Firstly, 776 drug compounds were screened in nanoscale which is cost-, time- and labor-saving. Fourteen compounds showed approximately 2-5-fold increase of transfection efficiency. Secondly, chemical components of cell culture surface and small volumes (200 nL) of cell culture medium were found to contribute to the maintenance of pluripotency of hiPSCs. Thirdly, ten groups of ternary protein combinations were identified to show support of undifferentiated culture of hiPSCs. Two of them were further evaluated to achieve long-term undifferentiated culture of hiPSCs, followed by their differentiation into three-germ layers. A summary and an outlook are presented at the end of the dissertation.
