Optimierung und Anwendung 1H-13C-korrelierter Experimente der Kernspinresonanzspektroskopie zur Quantifizierung lebensmittelrelevanter Mono- und Oligosaccharide

Die Quantifizierung ernährungsphysiologisch relevanter Mono- und Disaccharide in Lebensmitteln erfolgt überwiegend über enzymatische Methoden, die als §64-Methoden etabliert sind. Dabei können allerdings maximal drei Analyten gleichzeitig quantifiziert werden, wodurch die Durchführung der Methoden sehr zeitaufwändig werden kann. Zur beschleunigten Bestimmung von Mono- und Disacchariden wurden deshalb alternative Methoden entwickelt und deren Leistungsfähigkeit überprüft. Neben der Hochleistungsanionenaustauschchromatographie mit gepulst amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) wurden auch Experimente der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie) etabliert. ... mehrEin getestetes Protonenexperiment mit Wasserunterdrückung kann aufgrund vieler Signalüberlappungen im Spektrum lediglich wenige Mono- und Disaccharide gleichzeitig quantifizieren. Durch die Etablierung von Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC)-Experimenten und der erhöhten Auflösung der zweidimensionalen Spektren ist es möglich viele, lebensmittelrelevante Analyten gleichzeitig zu quantifizieren. HSQC-Experimente wurden aufgrund ihrer langen Analysenzeiten mit verschiedenen Methoden zur Messzeitreduktion kombiniert, wie der Verkürzung des D1-Delays und Non-Uniform Sampling. Durch die Kombination beider Ansätze kann die Quantifizierung in 30 min pro Messung erfolgen. Zusätzlich wurde eine mögliche Verwendung der Acceleration by Sharing Adjacent Polarization (ASAP)-HSQC-Pulssequenz getestet, die die sich durch eine kurze Messzeit von wenigen Minuten sowie durch eine erhöhte Auflösung auszeichnet. Sowohl die HSQC-Methoden mit verkürztem D1-Delay und NUS-Kopplung sowie die ASAP-HSQC-Methoden mit NUS-Kopplung konnten erfolgreich zur Quantifizierung von D-Glucose, D-Galactose, D-Fructose, Saccharose, Lactose, Maltose und Isomaltulose in verschiedenen Matrices angewandt werden.
Die analytische Trennung von Oligosacchariden ist aufgrund ihrer großen strukturellen Ähnlichkeiten oft schwierig. Die Mitglieder der sogenannten Raffinose-Familie Raffinose, Stachyose und Verbascose unterscheiden sich lediglich in jeweils einer Monosaccharideinheit voneinander und kommen vor allem in Leguminosen vor. HPAEC-PAD kann verwendet werden, um die Oligosaccharide chromatographisch zu trennen und zu quantifizieren. Eine schnellere Möglichkeit bietet ein in der 13C-Dimension optimiertes ASAP-HSQC-Experiment. Die Oligosaccharide der Raffinose-Familie konnten bei Anwendung der optimierten Methode richtig und präzise nach Extraktion aus dem Ausgangsmaterial quantifiziert werden.
Die entwickelten HSQC-Methoden konnten somit erfolgreich zur Quantifizierung von Mono- und Oligosacchariden in verschiedenen Lebensmittelmatrices eingesetzt werden. Dabei bestehen je nach individueller Anwendung sowohl Möglichkeiten zur Messzeitreduktion als auch zur Verbesserung der Auflösung.

The quantification of nutritionally relevant mono- and disaccharides in foods is predominantly carried out using enzymatic methods, which are established as §64 methods. However, a maximum of three analytes can be quantified at the same time, which can make the performance of the methods very time-consuming. Therefore, for the accelerated determination of mono- and disaccharides, alternative methods were developed and their performance was verified. In addition to high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR spectroscopy) experiments were established. ... mehrA tested proton experiment with water suppression can only quantify a few mono- and disaccharides simultaneously due to many signal overlaps in the spectrum. By establishing Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) experiments and the increased resolution of the two-dimensional spectra, it is possible to quantify many, food-relevant analytes simultaneously. HSQC experiments have been combined with various measurement time reduction methods, such as shortening the D1 delay and non-uniform sampling, due to their long analysis times. By combining both approaches, quantification can be performed in 30 min per measurement. In addition, a possible use of the Acceleration by Sharing Adjacent Polarization (ASAP) HSQC pulse sequence was tested, which features the short measurement time of a few minutes as well as increased resolution. Both the HSQC methods with shortened D1 delay and NUS coupling and the ASAP-HSQC methods with NUS coupling were successfully applied to quantify D-glucose, D-galactose, D-fructose, sucrose, lactose, maltose, and isomaltulose in various matrices.
The analytical separation of oligosaccharides is often difficult due to their high structural similarities. The members of the so-called raffinose family raffinose, stachyose and verbascose differ from each other only in one monosaccharide unit and are mainly found in legumes. HPAEC-PAD can be used to separate and quantify the oligosaccharides chromatographically. A faster option is provided by an ASAP-HSQC experiment optimized in the 13C dimension. The raffinose family oligosaccharides could be correctly and accurately quantified after extraction from the starting material using the optimized method.
Thus, the developed HSQC methods could be successfully applied for the quantification of mono- and oligosaccharides in various food matrices. Depending on the individual application, there are possibilities to reduce the measurement time as well as to improve the resolution.