Traditional Medicinal Plants into New Traditions: A Botanical Study of Tulsi ($\textit{Ocimum tenuiflorum}$)

Traditionelle medizinische Pflanzen (TMP) wurden schon lange von Menschen für Gesundheitsanwendungen eingesetzt. Heutzutage werden einige TMP als „Superfood“ beworben. Allerdings ist es fraglich, ob TMP einfach als Lebensmittel angesehen werden können, weil manche TMP giftige Verbindungen beinhalten, z.B. Tulsi bzw. Heiliges Basilikum (Ocimum tenuiflorum). Diese TMP produziert das genotoxische Phenylpropanoid Methyleugenol (ME), synthetisiert aus dem Enzym Eugenol O-Methyltransferase (EOMT). Trotzdem wird es aktuell als „Superfood“ beworben. Zusätzlich besteht bei Tulsi die Gefahr Lebensmittelbetrug. ... mehrDeswegen wurde Tulsi als Fallstudie ausgewählt. Die Ziele dieser Forschungsarbeit sind einerseits den Mechanismus besser zu verstehen, der die Biosynthese von ME reguliert und andererseits für das Problem des Lebensmittelbetrugs eineTechnik zur Identifikation der richtigen Tulsi Spezies mittels DNA-Barcoding zu entwickeln.
Zur Erreichung des ersten Ziels wurden die genetische Variation des EOMT Enzyms, der Phenylpropanoid-Weg und die subzelluläre Lokalisierung von EOMT untersucht. Die Ergebnisse zeigten Sequenzunterschiede der Nukleotidsequenz des EOMT Enzyms verschiedener Ocimum Arten innerhalb der Gattung. EOMT-basierte Phyolgenie erlaubte die Unterscheidung von zwei Gruppen, die erste benannt als Tulsi-Klade (O. tenuiflorum und O. gratissimum), die zweite benannt als Basilikum-Klade (O. basilicum, O. americanum, O. africanum und O. kilimandscharicum). Jedoch wurden Ähnlichkeiten gefunden zwischen den Sequenzen der Basilikum-Klade und ausschließlich O. gratissimum aus der Tulsi-Klade. Zusätzlich war O. gratissimum die einzige Art der Tulsi-Klade, die unter den verwendeten Wachstumsbedingungen kein ME produzierte, sowie ME auch von keiner der Arten der Basilikum-Klade produziert wurde. Deswegen wird die Hypothese aufgestellt, dass Ähnlichkeiten der Aminosäuresequenz in der Basilikum-Klade und O. gratissimum aus der TulsiKlade relevant sind für die Synthese von ME in der Gattung Ocimum. Diese Ergebnisse deuten auf eine starke genetische Komponente, welche bei der Synthese von ME eine Rolle spielt.
Dann wurde der Phenylpropanoid-Weg bei O. tenuiflorum durch hohe Dosierung von UV-B Strahlung als Stressfaktor untersucht. Zwei Chemotypen von O. tenuiflorum wurden verwendet, Krishna und Rama. Die genetische Ausprägung mehrerer Enzyme zeigten unterschiedliche Regulierungsmuster des Phenylpropanoid-Wegs zur Synthese von ME im Vergleich zwischen den zwei Chemotypen. Die vorgelagerten Reaktionen zu ME in Rama schienen stark von dem Enzym Kaffeesäure O-Methyltransferase reguliert zu sein. Wohingegen bei Krishna, das Enzym Caffeoyl-CoA O-Methyltransferase auch eine wichtige Rolle zu spielen schien. Zusätzlich scheint es, dass neben Phenylalanin auch Tyrosin ein relevanter erster Ausgangsstoff des Phenylpropanoid-Wegs sein kann in Ocimum Arten.
Die subzelluläre Lokalisierung von EOMT wurde im Nukleus und dem Cytosol von transformierten BY-2 Zellen gezeigt. Die cytosolische Lokalisierung von EOMT entspricht der Lokalisierung anderer Komponenten des Phenylpropanoid-Wegs, mit Enzymen wie PAL und Eugenol-Synthase. Jedoch wurde die nukleäre Lokalisierung von EOMT in dieser Arbeit erstmalig gezeigt, sodass weitere Forschung dazu notwendig ist, um dieses Ergebnis zu verstehen.
Das zweite Ziel war das Problem des Lebensmittelbetrugs durch DNA-Barcoding zu adressieren. DNABarcoding zur Identifikation von O. tenuiflorum in kommerziellen Proben wurde erreicht durch eine einstufige Technik mit einem merkmalsunabhängigen Marker (psbA-trnH igs) und mit einem merkmalsabhängigen Marker erreicht (EOMT’). Der letztgenannte basierte auf dem Enzym EOMT. Diese Untersuchungsmethode erlaubt die Unterscheidung von O. tenuiflorum von anderen Ocimum Arten in Referenzpflanzen und kommerziellen Proben.
Insgesamt zeigte die Tulsi Fallstudie die Komplexität dabei eine spezifische TMP als Lebensmittel oder „Superfood“ zu erwägen. Darüber hinaus stellte diese Fallstudie den Forschungsbedarf heraus bei der Regulierung der Stoffwechselproduktsynthese in Pflanzen und DNA-Barcoding Techniken. Deswegen wird empfohlen mehr vorsorgliche Forschung durchzuführen, bevor eine TMP als Lebensmittel oder sogar als sogenanntes „Superfood“ betrachtet wird.

Traditional medicinal plants (TMP) have been long used by humans for health purposes. Nowadays, several TMP are advertised as ‘superfoods’. Yet, it is questionable whether TMP should be straightforwardly considered as food products because some TMP have toxicologically relevant compounds, such as Tulsi or Holy Basil (Ocimum tenuiflorum). This TMP also produces the genotoxic phenylpropene methyleugenol (ME), synthesised by the enzyme eugenol O-methyltransferase (EOMT). However, it is currently advertised as a ‘superfood’. Moreover, Tulsi is susceptible to food fraud. Therefore, Tulsi was selected as the case study for this research. ... mehrThe aim is on one hand, to better understand the mechanisms under which the synthesis of ME is regulated, and on the other hand, to address the issue of food fraud through developing a species identification technique with DNA barcoding.
To achieve the first aim, the genetic variation of the EOMT enzyme, the phenylpropanoid pathway, and the subcellular localization of EOMT were studied. The results disclosed differences on the nucleotide sequence of the EOMT within the genus Ocimum. EOMT-based phylogeny revealed two distinctive groups, the first one called the Tulsi clade (O. tenuiflorum and O. gratissimum), and the second one called the Basil clade (O. basilicum, O. americanum, O. africanum and O. kilimandscharicum). However, similarities were found between the sequences of the Basil clade and only O. gratissimum sequences from the Tulsi clade. Furthermore, O. gratissimum was the only accession from the Tulsi clade that did not produce ME in the given growing conditions. Also none of the Basil clade accessions produced ME. Thus, it is hypothesised that the amino acid similarities between O. gratissimum and the Basil clade sequences, are relevant for the synthesis of ME in the genus Ocimum. These results suggest the strong genetic component playing a role on the ME synthesis.
Then, the phenylpropanoid pathway in O. tenuiflorum was researched by using high doses of UV-B radiation as stress factor. Two O. tenuiflorum chemotypes were used, Krishna and Rama. The gene expression of several enzymes showed different regulation patterns on the phenylpropanoid pathway for the synthesis of ME when comparing the two chemotypes. The upstream reactions to ME in Rama seemed to be highly regulated by the enzyme caffeic acid O-methyltransferase. Whereas in Krishna, the enzyme caffeoyl-CoA O-methyltransferase seemed to play an important role as well. In addition, it seems that besides phenylalanine, tyrosine might also be a relevant first substrate of the phenylpropanoid pathway in Ocimum sp.
In relation to the subcellular localization studies, EOMT was localized in the nucleus and the cytosol of transformed BY-2 cell. The cytosolic localization of EOMT is in line with the localization of other phenylpropanoid pathway enzymes such as PAL and eugenol synthase. However, the nuclear localization of EOMT was unprecedented and further research is needed to understand this outcome.
The second aim was to address the issue of food fraud via DNA barcoding. DNA barcoding for O. tenuiflorum discrimination in commercial samples was achieved through a one-reaction assay using a trait-independent marker (psbA-trnH igs) together with a trait-related marker (EOMT’). The latter was based on the enzyme EOMT. This assay allowed for discrimination of O. tenuiflorum from other Ocimum sp. in reference plants and commercial samples.
Overall, the Tulsi case study highlights the complexity of considering a particular TMP as a food or ‘superfood’ because of the possible presence of toxicologically relevant compounds. Further, this study exposed the need of research regarding the regulation of metabolites synthesis in plants and DNABarcoding techniques. Therefore, it is suggested to carry out more precautionary research prior considering a TMP as a food or even so-called ‘superfood’.