Die Charakterisierung des Transkriptionsfaktors Hdp2 und dessen Rolle in der biotrophen Phase von $\textit{Ustilago maydis}$

Ustilago maydis ist ein phytopathogener Basidiomyzet, dessen dimorpher Lebenszyklus die sexuelle und pathogenen Entwicklung miteinander verknüpft und in Abhängigkeit des Wirts Zea mays abläuft. Die Transition von saprophytischer zu biotropher Phase erfordert hierbei eine streng regulierte und komplexe Integration verschiedenster Signalwege, die über ein hierarchisches Transkriptionsfaktornetzwerk realisiert wird.
Nach erfolgter Zellfusion zweier kompatibler Sporidien, die über ein Pheromon-/Rezeptorsystem vermittelt wird, bildet sich ein dikaryotisches Filament, welches die biotrophe Phase einleitet. ... mehrDie hierbei eingesetzte Regulationskaskade unterliegt der Kontrolle der vom b-Locus kodierten, heterodimeren Transkriptionsfaktoren bE und bW, die neben dem filamentösen Wachstum und einem G2-Zellzyklusarrest die Induktion weiterer Transkriptionsfaktoren auslösen. Der bW/bE-abhängig exprimierte Zinkfingertranskriptionsfaktor Rbf1 steuert dabei als zentraler Regulator 90 % der b-regulierten Gene. Rbf1 ist, unabhängig von b, sowohl notwendig als auch ausreichend für die Initiation der pathogenen Entwicklung; für den weiteren Infektionsverlauf ist b notwendig. Die Expression von rbf1 während der Infektion unterliegt einer strengen Kontrolle; während es auf der Blattoberfläche zur Induktion kommt, reprimiert die Interaktion zwischen bW/bE und Clp1, einem weiteren direkt b-induzierten Faktor, die rbf1 Expression. Zwei Tage nach der Infektion ist keine rbf1 Expression mehr nachweisbar.
Mikroskopische und qRT-PCR Analysen in dieser Arbeit konnten zeigen, dass rbf1 lediglich für den Übergang zur biotrophen Phase benötigt wird, da eine prolongierte Expression zu einer aberranten Zellkernverteilung und zum Verlust der Virulenz führt. Während rbf1 selbst jedoch unmittelbar nach der Penetration nicht mehr aktiv ist, werden ungefähr die Hälfte der rbf1-regulierten Gene auch im weiteren Infektionsverlauf in planta exprimiert. Diese Weiterführung der Regulation wird durch die rbf1-abhängigen Transkriptionsfaktoren Hdp2 und Biz1 realisiert. Neben Aufrechterhaltung der Expression rbf1-vermittelter Gene, treibt vor allem Hdp2 die biotrophe Phase von U. maydis voran. ChIP-Seq Analysen konnten die Bindung von Hdp2 an zahlreiche Promotoren von pathogenitätsrelevanten Genen in planta zeigen und deuten nicht nur auf eine Regulation von charakterisierten Effektoren, sondern auch auf eine Weiterführung der Signalkaskade durch die Kontrolle weiterer Transkriptionsfaktoren hin.
hdp2 selbst unterliegt einer komplexen Kontrolle, die ein Zusammenspiel aus verschiedenen Transkriptionsfaktoren und zwei alternativen Promotoren erfordert. Auf der Blattoberfläche wird hdp2 von Rbf1 induziert, das nach der Penetration der Pflanze von Biz1 abgelöst wird. Die Übernahme der Regulation durch Biz1 erfolgt, nachdem ein gewisser Schwellenwert von Biz1 erreicht ist und ist gleichzeitig mit einem Wechsel der Promotoren verbunden. Während Rbf1 vor einem 5‘-Exon von hdp2 bindet, findet die Bindung von Biz1 innerhalb des Introns statt, wodurch ein Transkript entsteht, das ein alternatives Startcodon bei der Translation verwendet und Hdp2 um 55 Aminosäuren verlängert. Die beiden Hdp2 Isoformen, Hdp2S und Hdp2L, weisen keine signifikanten Unterschiede bezüglich konservierter Domänen auf und zeigen keine Unterschiede hinsichtlich der Induktion von Zielgenen oder der pathogenen Entwicklung. Die Proteinvarianten sind damit als Nebenprodukte der Verwendung von zwei unterschiedlichen entwicklungsabhängigen Promotoren zu interpretieren.
Die Verwendung alternativer Promotoren wurde genomweit analysiert und konnte bei weiteren pathogenitätsrelevanten Genen identifiziert werden. Dies liefert Hinweise auf eine stadienspezifische Regulation dieser Gene während der Transition von saprophytischer zu biotropher Phase von U. maydis und wird von den Hauptregulatoren Rbf1, Hdp2 und Biz1 maßgeblich kontrolliert. Die entwicklungsspezifische Regulation besitzt dabei eine Ähnlichkeit mit der in höheren Eukaryoten und ist ein Novum in Pilzen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen wesentlich dazu bei, das Verständnis für den regulatorischen Aspekt der frühen biotrophen Phase und deren beteiligte Faktoren näher zu erweitern, wodurch neue Anhaltspunkte für anschließende Untersuchungen der pathogenen Entwicklung von U. maydis erlangt werden konnten.

Ustilago maydis is a phytopathogenic basidiomycete, whose life cycle links sexual and pathogenic development in dependency of its host Zea mays. The transition from the saprophytic to the biotrophic life style requires a strictly regulated and complex integration of various signaling pathways, which is realised by a hierarchical network of transcription factors.
After cell fusion of two compatible sporidia, facilitated via a pheromone/receptor system, a dicaryotic filament is formed, ushering in the biotrophic stage. The regulatory cascade employed in this process is subject to the control of heterodimeric transcription factors bE and bW encoded by the b-locus, which triggers the induction of other transcription factors in addition to filamentous growth and a G2 cell cycle arrest. ... mehrIn this context, the bE/bW-dependently expressed zinc finger transcription factor Rbf1 acts as the central regulator controlling 90 % of b-regulated genes. Rbf1, independent of b, is both required and sufficient for the initiation of pathogenic development; b is absolutely essential for the further course of infection. The expression of rbf1 during infection is precisely controlled; while induction occurs on the plant surface, the interaction between bW/bE and Clp1, another b-regulated factor, represses rbf1. Two days post infection, rbf1 expression is no longer detectable.
Microscopy and qRT-PCR experiments demonstrate, that rbf1 is only required for the transition into the biotrophic stage, as prolonged expression leads to an aberrant distribution of nuclei and results in the loss of virulence. However, while rbf1 itself is immediatley inactivated after plant penetration, approximately half of the rbf1-regulated genes continue to be expressed in planta as infection progresses. The continuation of regulation is realised by the rbf1-dependent transcription factors Hdp2 and Biz1. Apart from maintaining expression of rbf1-mediated genes, Hdp2 in particular drives the biotrophic phase of U. maydis. ChIP-Seq analysis was able to show binding of Hdp2 to numerous promoters of pathogenicity-relevant genes in planta, suggesting not only regulation of well characterised effectors, but also continuation of the signaling cascade through control of additional transcription factors.
hdp2 itself is subject to a complex regulation, necessitating an interplay of different transcription factors and two alternative promoters. On the plant surface hdp2 is induced by Rbf1, which is superseded by Biz1 after plant penetration takes place. The accession of regulation by Biz1 occurs once a certain threshold of Biz1 is exceeded and is accompanied by a change of promoters. While Rbf1 binds upstream of a 5‘-exon of hdp2, binding of Biz1 occurs within an intron, resulting in a transcript, which uses an alternative start codon at translation, elongating Hdp2 by 55 amino acids. Both Hdp2 isoforms, Hdp2S and Hdp2L, exhibit no significant disparities in terms of conserved domains and show no differences regarding target gene induction or impact on pathogenic development. Thus, the protein variants can be interpreted as byproduct of the use of two different stage-specific promoters.
The use of alternative promoters was observed among other virulence-dependent genes by genome-wide analysis. This points to a stage-specific regulation during transition from saprophytic to biotrophic life style of U. maydis and is primarily controlled by the main regulators Rbf1, Hdp2 and Biz1. The development-specific regulation here has similarity to that in higher eukaryotes and is a novelty in fungi.
The findings of this work contributed substantially in comprehending the regulatory aspect during early stages of biotrophy and its involved factors, providing a new basis for subsequent studies of the pathogenic development of U. maydis.