Charakterisierung des cysteinreichen Virulenzfaktors CyrA im Nematoden-fangenden Pilz Duddingtonia flagrans

Nematoden-fangende Pilze (NFP) sind eine Gruppe faszinierender, karnivorer Mikroorganismen. Bei Nährstoffmangel sind sie in der Lage vom saprotrophen Wachstum zu einem räuberischen Lebensstil zu wechseln. Dieser Wechsel geht mit der Ausbildung hoch-spezialisierter Fallenstrukturen und der Sekretion zahlreicher Signalmoleküle einher. Die Fallen werden ausgebildet, sobald die Pilze Nematoden-spezifische Ascaroside wahrgenommen haben. Nun locken die Räuber ihre Beute in die Fallen, indem sie attraktive, olfaktorische Signale abgeben. Es folgt ein ganzes Arsenal sekretierter Moleküle, um die Kolonisation der Nematoden durch die Pilze sicherzustellen. ... mehrDazu sind zunächst vor allem lytische Enzyme notwendig. Da der Fangvorgang der räuberischen Pilze relativ schnell abläuft und keine längerfristige Interaktion bestehen muss, stellt sich die Frage, ob neben den lytischen Enzymen auch kleine sekretierte Proteine eine Rolle spielen. Diese SSPs sind als Virulenzfaktoren und Effektorproteine in vielen tier- und pflanzenpathogenen Pilzen und Bakterien beschrieben. Da die Nematoden im Kontakt mit den Fallen Abwehrmechanismen aktivieren, könnten solche Virulenzfaktoren auch für die Überwindung der Strategien der Nematoden für NFP wichtig sein.
In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen dem Nematoden-fangenden Pilz Duddingtonia flagrans und dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans untersucht. Bioinformatische Analysen des Genoms haben ergeben, dass das Sekretom des NFPs 249 SSPs beinhaltet. Der Virulenzfaktor-Kandidat CyrA (cysteine rich protein A) ist eines dieser SSPs und wurde charakterisiert, um seine Rolle während der Attacke aufzuklären. Das sekretierte Protein ist außerdem eines der 170 cysteinreichen Proteinen und wurde bioinformatisch als putativer Effektor vorhergesagt. Die Induktion der Genexpression von cyrA in den Fallen wurde mit Hilfe einer qRT-PCR-Analyse und einem Promotor-Reporterassay gezeigt. Die Lokalisation mit fluoreszenten Proteinen ergab, dass CyrA in dynamischen, vesikelartigen Strukturen in den Fallen lokalisiert und hier an der Innenseite akkumuliert. Nach der Penetration lokalisierte das Protein im Infektionsbulbus, wo es vermutlich sekretiert wird. Besonderheiten des Sekretionswegs in den Fallen wurden durch die Fusion von GFP mit verschiedenen Signalpeptiden deutlich, die fast alle zur Lokalisation in Vesikeln in den Fallen führten, während im vegetativen Myzel keine Vesikel zu beobachten waren. Durch die Deletion des zu Saccharomyces cerevisiae exo70 orthologen Gens exoA, einer Komponente des Exocyst-Komplexes, wurde außerdem gezeigt, dass die Akkumulation von CyrA im Infektionsbulbus von diesem Proteinkomplex abhängig ist. Das cyrA Gen wurde mittels homologer Rekombination deletiert und Langzeitbeobachtungen des Infektionsprozess zeigten eine verringerte Virulenz der Mutante, die einen längeren Zeitraum für die Paralyse der Nematoden benötigte. Die heterologe Expression von cyrA in C. elegans führte zu einer verringerten Lebenszeit der Nematoden und gab Hinweise auf eine mögliche Rolle der C. elegans Coelomocyten während der Interaktion.
Im Laufe dieser Arbeit wurde CyrA als Virulenzfaktor von D. flagrans identifiziert, der für die volle Virulenz des Pilzes benötigt wird. Es wurde die Hypothese bestätigt, dass SSPs eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen NFP und Nematoden spielen. Außerdem wurden wichtige Aspekte der Zellbiologie hinter der Sekretion von Virulenzfaktoren Nematoden-fangender Pilze beleuchtet und erste Hinweise auf eine Rolle der Coelomocyten bei der Immunantwort von C. elegans erlangt. Diese Arbeit erlaubt einen ersten Einblick in das bisher noch weitestgehend unerforschte Feld der Analyse von Virulenzfaktoren Nematoden-fangender Pilze.

Nematode-trapping fungi (NTF) are a fascinating group of carnivorous microorganisms. In a low-nutrient environment, they are able to switch from saprotrophic growth to a predatory lifestyle. This switch is indicated by the formation of highly specialized trapping structures and the secretion of numerous signaling molecules and low molecular compounds. The traps are formed upon sensing of nematode-specific ascarosides. The predators lure their prey into the traps by emitting attractive olfactory signals. This is followed by secretion of a full arsenal of secreted molecules to enable colonization of the nematodes by the fungi. ... mehrInitially, mostly lytic enzymes are necessary for this. Since the capturing process of the predatory fungi is relatively fast and no long-term interaction needs to be established, the question arises whether small, secreted proteins also play a role in addition to the lytic enzymes. These virulence factors and effector proteins have been described in many animal- and plant pathogenic fungi and bacteria. Since nematodes activate defense mechanisms when in contact with traps, such virulence factors could also be important in overcoming nematode strategies for NTF.
In this work, the interaction between the nematode-trapping fungus Duddingtonia flagrans and the nematode Caenorhabditis elegans was analyzed. Bioinformatic analyses of the genome have revealed that the D. flagrans secretome contains 249 SSPs. The virulence factor candidate CyrA (cysteine rich protein A) is one of these SSPs and was characterized to elucidate its role during attack. The secreted protein is also one of the 170 cysteine rich proteins and was bioinformatically predicted to be a putative effector. Induction of the gene expression of cyrA in the traps was demonstrated by qRT-PCR analysis and a promoter-reporter-assay. Localization analyses with fluorescent proteins revealed that CyrA localized in dynamic vesicle-like structures in the traps where it accumulated on the inner surface. After penetration, the protein localized in the infection bulb, where it is presumably secreted. Peculiarities of the secretory pathway in the traps became evident from the fusion of GFP with various signal peptides, almost all of which led to localization in vesicles in the traps, whereas no vesicles were observed in the vegetative mycelium. Deletion of the exoA gene orthologous to exo70, a component of the Exocyst-complex, further demonstrated that accumulation of CyrA in the infection bulb was dependent on this protein complex. The cyrA gene was deleted by homologous recombination and long-term observations of the infection process showed reduced virulence of the mutant as indicated by a prolonged time to paralysis. Heterologous expression of cyrA in C. elegans resulted a decrease of nematode lifespan and provided evidence for a possible role of C. elegans coelomocytes during the interaction.
In this work, CyrA was identified as a virulence factor of D. flagrans that is required for full virulence of the fungus. The hypothesis that SSPs play an important role in the interaction between NFP and nematodes was confirmed. In addition, important aspects of the cell biology behind the secretion of virulence factors of nematode-trapping fungi were elucidated and first evidence for a role of coelomocytes in the immune response of C. elegans was obtained. This work allows a first glance into the still largely unexplored field of virulence factor analysis in nematode-trapping fungi.