Abstract:
Die Wiederaufforstung der abgetorften Moorflächen in Deutschland benötigt eine große Menge an Torfmoos-Saatgut, welche aus den Naturreservaten nicht sofort gedeckt werden kann. Die Bereitstellung der ausreichenden Torfmoosbiomasse kann in Photobioreaktoren realisiert werden. Zu einer optimalen Vermehrung von Torfmoosen im Bioreaktor ist es notwendig, zunächst die Kultivierungsparameter zu finden, welche das Wachstum der Torfmoose und ihre Produktivität unter in-vitro Bedingungen beeinflussen. In von unten beleuchteten 500 mL Schüttelkolben gelang es, wichtige biologische Aspekte für die in-vitro Vermehrung von S. ... mehrpalustre sowie S. rubellum aufzudecken. Bislang war eine Kultivierung von Sphagnen im anorganischen Knop-Medium nicht realisierbar. Mit einer kontinuierlichen Begasung (0,1 vvm, x (CO2)=1 %) war es möglich, S. palustre reproduzierbar zu kultivieren. Fünfwöchige Kultivierungen im anorganischen Knop-Medium mit 1,25 mmol·L-1 NH4NO3 bei einer Photonenflussdichte (PFD) von 100 μmol·m-2·s-1 produzierten eine durchschnittliche Biomassekonzentration von 6,85 ± 0,62 gBTM∙L-1. Bei einem wöchentlichen Medienwechsel (Knop-Medium 20 % (v/v), VM= 250 mL) ließen sich auch weitere Torfmoos-Spezies wie S. rubellum in-vitro im Schüttelkolben vegetativ vermehren und vergleichsbare Biomassekonzentration (c(BTM)=5,97± 0,41 g∙L-1) wie der S. palustre erreichen. Für das photoautotrophe Wachstum benötigte S. palustre 1 % des CO2 im Zugas (v/v) bei einer Photonenflussdichte von 100 μmol·m-2·s-1, während bei PFD = 200 μmol·m-2·s-1 der molare CO2-Anteil im Zugas mindestens 2 % betragen musste, um das Wachstum von Torfmoosen zu stimulieren. Die reine Luftbegasung der Mooskultur unabhängig von der getesteten eingestrahlten Photonenflussdichte (100 - 200 μmol·m-2·s-1), zeigte sich für die Biomasseproduktion als nicht ausreichend. Eine Erhöhung der Lichtverfügbarkeit (200 → 500 μmol∙m-2·s-1) verbesserte nicht die Biomasseproduktion, sondern traten Chloropyllabbauerscheinungen auf. Die spektrale Zusammensetzung der LED-Module zur künstlichen Beleuchtung der Mooskultur war ein wichtiger Parameter für das Wachstum von S. palustre. Eine minimale Photonenflussdichte von 18,9 μmol·m-2·s-1 im Blaubereich (λ=430 und 490 nm) war notwendig, um das Wachstum von S. palustre zu stimulieren. Daher eigneten sich die kaltweißen LEDs statt der Warmweißen für das Wachstum von Torfmoosen mit künstlicher Beleuchtung. Eine Dauerbeleuchtung war nicht erforderlich und ähnliche Biomassekonzentration wurden bei einem Hell/Dunkel-Zyklus von 16/8 (h·h-1) erreicht. Zwei unterschiedliche Stickstoffquellen (Ammonium und Nitrat) waren für das Wachstum von S. palustre essentiell. Das Wachstum von S. palustre im Knop-Medium mit Nitrat als N-Quelle (c(KNO3) = 10,94 mmol·L-1) erwies sich als nicht zufriedenstellend, sowie eine Ammoniumkonzentration von 10,94 mmol·L-1 war für das Moos toxisch. Neben der Produktivität wirkte sich die Ammoniumkonzentration auf die Morphologie der Mooskultur aus, welche durch eine sphärische Struktur mit mehreren Capitula und reduziertem Längenwachstum gekennzeichnet war. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Stickstoffquellen den Pigmentgehalt beeinflussen, wobei eine Senkung des Gehalts an Chlorophyll mit Nitrat als einzige N-Quelle auftrat. Die übliche pH-Senkung im Knop-Medium war auf die Ammonium-Aufnahme zurückzuführen und nicht auf den Kationenaustausch an der Zellwand der Moospflanze. Die Verringerung des pH-Wertes war für das Wachstum von Torfmoosen nicht notwendig, da eine Kultivierung bei einem konstanten pH-Wert durch Zugabe eines Puffers (Piperazin-1,4-bis(propansulfonsäure) die produzierte Biomasse nicht signifikant beeinflusste. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der neue Ausgangspunkt für die weitere Optimierung der Prozessparameter von S. palustre in Submerskultur im Batchprozess bestimmt: LED-Beleuchtung durch kaltweiße LEDs, mit einer PFD=200 μmol·m2·s-1, 16/8 Hell- Dunkel-Zyklus; Begasung mit einem molaren CO2-Anteil von 2 % im Zugas und einer Begasungsrate von 0,08 vvm; 1,0faches Knop-Medium mit 1,25 mmol·L-1 NH4NO3 mit einem Anfang-pH-Wert von 4,0.
Bislang war ein kontrollierter emerser Photobioreaktor zur Torfmooskultivierung, der auf den Kultivierungsbedingungen im Hochmoor basiert, nicht bekannt. Auf Grundlage des Konzepts des Trickle-Bed-Reaktors wurde ein 1,5 L emerser Photobioreaktor (Moosbettreaktor) entwickelt, welcher eine axenische Kultivierung unter kontrollierten Bedingungen (PFD, Temperatur, CO2) ermöglichte. Im Moosbettreaktor wuchsen die Torfmoose auf einem wasserdurchlässigen Speichervlies
aus Polypropylen und wurden von unten stündlich mit Medium versorgt. Die Nährstoffzufuhr der Torfmoosbiomasse von oben mittels einer Zerstäubungsdüse war für S. palustre schädlich. Das für die Photosynthese benötigte CO_{i2} wurde am Reaktorboden eingeleitet und nach dessen Durchströmen der Torfmoosschicht, zusammen mit dem produzierten Sauerstoff von oben aus dem Reaktor ausgetragen. Die Energiequelle für das photoautotrophe Wachstum von Torfmoosen wurde von oben von einem Lichtmodul bereitgestellt, des mit kaltweißen LEDs ausgestattet war. Der Moosbettreaktor ermöglichte es, das Torfmoos S. palustre, sowie die zwei anderen Moosspezies S. rubellum und S. fimbriatum, welche langsam in Submerskultur im Batchverfahren wuchsen, emers und axenisch zu kultivieren. Bei einer Dauerbeleuchtung mit einer PFD von 200 μmol·m-2·s-1 und einer Begasungsrate von 25 mL∙min^-1 mit x(CO2)=2 % erreichte S. palustre eine durchschnittlichen Längenzuwachsrate von 0,17 cm·d^-1, S. rubellum von 0,09 cm·d^-1 und S. fimbriatum von 0,20 cm·d^-1. Als Kulturmedium wurde 0,2faches Knop-Medium mit 0,25 mmol·L-1 NH4NO3 mit einem Volumen von 800 mL verwendet und um 0,216 g∙L-1 Mg(NO3)2 erweitert, um den Chlorophyllabbau in den oberen Moosschichten zu vermeiden. Unter diesen Bedingungen zeigte der Moosbettreaktor eine hohe Flächenproduktivität von 12,6 gBTM∙m-2∙d-1 (312 gFM∙m-2∙d-1 ) im Vergleich zum Freilandmooswachstum. Mit dem entwickelten Reaktorsystem ist es gelungen, die Moose in einem ausdifferenzierten Zustand in einem kompakten Moosteppich wachsen zu lassen. Der Moosbettreaktor eröffnet die Möglichkeit zur kostengünstigen Produktion von Torfmoosbiomasse mit naturnaher Morphologie, da nur niedrige Betriebskosten, welche lediglich durch die Begasung zum Gaseintrag bestimmt werden, erwartet werden. Darüber hinaus hat der Moosbettreaktor das Hochskalierungspotenzial durch Stapeln baugleicher Reaktoretagen. Anschließend wurde im Rahmen diese Arbeit die Produktion von Torfmoospflanzen mit vielen Innovation und Capitula im Labormaßstab fokussiert, weil sich Pflanzen mit dieser Morphologie für die Aussaat am besten eignen. In einem horizontal betriebenen 5 L Wave-Photobioreaktor betrug die volumetrische Produktivität 2,8 gFM ·L-1·d-1 und die Moose wuchsen in sphärischer Struktur mit vielen Innovationen. Trotz der erfüllten Saatgutqualität ist dieser Reaktortyp für die zukünftige groß-skaligen Torfmoosproduktion aufgrund der hohen Betriebskosten und eingeschränkten Maßstabvergrößerung ungeeignet.
Die zweite Alternative eines submersen Kultivierungssystems zur Maßstabvergrößerungen war der vertikal aufgebaute 60 L Schlauchreaktor aus der Mikroalgenkultivierung. Im Reaktor wuchs das Torfmoos S. palustre unter konstanter Temperatur im offenen Betrieb, wobei auf die Autoklavierung des Mediums (anorganisches 1,0faches Knop-Medium mit 1,25 mmol·L-1 NH4NO3) verzichtet wurde. Ein LED-Lichtmodul, bestehend aus kaltweißen LEDs, beleuchtete den Reaktor ganztätig mit einer PFD=200 μmol·m-2·s-1. Begast wurde mit einer Begasungsrate von 0,03 vvm und mit einem x(CO2)=2 %. So erzeugte der Schlauchreaktor Torfmoosbiomasse mit vielen Capitula. Da im Schlauchreaktor wesentlich weniger Turbulenz vorliegt, entstanden lockere Moosstrukturen. Die erreichte Produktivität von 0,02 gBTM∙L-1∙d-1 (0,43 gFM∙ L-1∙d-1) war jedoch gering, da die Torfmoose durch die Gasblasen starken Auftrieb erfuhren und dadurch nicht die gesamte Leuchtfläche zum Wachstum nutzen konnten. Trotz der Tatsache, dass sich der Schlauchreaktor in Hinsicht auf die Produktivität
als nicht zufriedenstellend erwies, sollte dieser Reaktortyp zur Produktion von Torfmoosbiomasse weiterverfolgt werden. Erstens unterscheidet sich der Schlauchreaktor grundlegend von vorhandenen submersen Photobioreaktoren, bei denen die Maßstabvergrößerung technisch nicht möglich ist. Die Erhöhung der Produktionskapazität kann durch Reihenkultivierung der einzelnen Schlauchreaktoren realisiert werden, ohne die Lichtverhältnisse im Reaktor negativ
zu beeinflussen. Zweitens kann die volumetrische Produktivität erhöht werden, indem Konzepte des Airliftreaktors mit verbesserter axialer Durchmischung in das System integriert werden und die Kultivierung als Fed-Batch mit sequenzierter Teilernte erfolgt.
Es zeigte sich, dass S. palustre in der Lage ist, in verschiedenen Reaktortypen zu wachsen, und dass sich alle drei getesteten Reaktortypen für die Herstellung von Torfmoosbiomasse im kleinen Maßstab eignen. Die verschiedenen Verhältnisse innerhalb der Photobioreaktoren rufen Variationen der Torfmoosmorphologie hervor, die vermutlich auf die unterschiedlichen Licht- und Krafteinwirkung zurückzuführen sind. Je nach erwünschter Saatgutqualität können die drei vorgestellten
Photobioreaktoren weiterentwickelt und hochskaliert werden, um für die zukünftige industrielle Torfmoosproduktion verwendet zu werden.
Abstract (englisch):
The renaturation of the depleted peat bogs in Germany requires a large amount of peat moss biomass, which cannot be covered from the natural reserves. The supply of sufficient biomass can be realized in photobioreactors.
For an optimal propagation of Sphagnum mosses in the bioreactor, first of all it is necessary to find the main in vitro cultivation parameters, that influence the peat moss growth and productivity. In 500 mL shake flasks illuminated from below, it was possible to lay the information foundation for the in vitro growth of S. palustre as well as S. rubellum. ... mehrSo far, cultivation of Sphagnen was not feasible in inorganic Knop-Medium. With continuous gassing (0.1 vvm, xCO2=1 %) it was possible to cultivate S. palustre reproducibly. Five-week cultivations in inorganic Knop-Medium containing 1.25 mmol·l-1 NH4NO3 at a photon flux density (PFD) of 100 μmol·m-2·s-1 yielded an average biomass concentration of 6.85 ± 0.62 gDW∙l-1. With a weekly medium change (Knop-Medium 20 % (v/v), VM= 250 mL), other Sphagnum species such as
S. rubellum could also be propagated vegetatively in the shake flasks, with a comparable biomass concentration (c(DW)=5.97± 0.41 g∙l-1) as S. palustre. For the photoautotrophic growth, S. palustre required 1 % of CO2 in the gas mixture (v/v) at a photon flux density of 100 μmol·m-2·s-1, whereas at PFD = 200 μmol·m-2·s-1, the molar CO2 content in the gas mixture had to be at least 2 % to stimulate peat moss growth. Without additional CO2 aeration the moss growth was insufficient, regardless of the tested irradiated photon flux density (100-200 μmol·m-2·s-1). Increasing the light availability (200 → 500 μmol·m-2·s-1) did not improve biomass production, but chlorophyll degradation occurred. The spectral composition of the LED modules used for the artificial illumination of the moss culture was an important parameter for S. palustre growth. A minimum photon flux density of 18.9 μmol·m-2·s-1 in the blue spectral region (λ=430 and 490 nm) was necessary to stimulate S. palustre growth. Therefore, the cool white LEDs were more suitable than the warm white LEDs for the growth of Sphagnum mosses with artificial illumination. Continuous illumination was not required and similar biomass concentrations were achieved with a light/dark cycle of 16/8 (h·h-1). Both nitrogen sources (ammonium and nitrate) were mandatory for S. palustre growth. The growth of S. palustre in Knop-Medium with nitrate as only nitrogen source (c(KNO3) = 10.94 mmol·l-1) proved to be unsatisfactory. Also, an ammonium concentration of c(NH4Cl) = 10.94 mmol·l-1 was toxic to the mosses. Beside the low reached productivity, the ammonium concentration affected the morphology of the moss culture, which was characterized by a spherical structure with several capitula and reduced length growth. In addition, nitrogen sources were shown to affect pigment content, with a decrease in chlorophyll content occurring in the medium with nitrate as the only nitrogen source. The usual pH decrease in the Knop-Medium was caused by the ammonium uptake and not by the cation exchange capacity of the moss plant. The pH reduction was not necessary for the growth of Sphagnum mosses, since a cultivation at a constant pH by adding a buffer (1,4-Piperazine bispropanesulfonic acid) did not significantly lower the amount of produced biomass. Based on these results, the new standard condition for a further optimization of the process parameters of S. palustre in submerse culture in batch process was determined: cold warm LED lighting, PFD=200 μmol·m-2·s-1, 16/8 light-dark cycle; 2 % mixture of air and CO2 and aeration rate of 0.08 vvm; Knop-Medium containing 1.25 mmol·l-1 NH4NO3 with start pH of 4.0.
Until now, a controlled emerse photobioreactor for peat moss cultivation, based on cultivation conditions similar to peat bogs, was not known. Starting from the concept of a trickle-bed reactor, a 1.5 l emerse photobioreactor (moss-bed reactor) was developed, which allowed axenic cultivation under controlled conditions (PFD, temperature, CO2). In the mossbed reactor, peat mosses grew on a water-permeable storage fleece made of polypropylene and were supplied with medium from below every hour. Sprinkling the peat moss biomass using a full-cone nozzle was detrimental to S. palustre. The CO2 required for photosynthesis was introduced at the bottom of the reactor and, after flowing through the peat moss layer, was discharged from the top of the reactor, along with the produced oxygen. The energy source for photoautotrophic growth of moss was provided from above by a LED lighting module, which consisted of cool white LEDs. With the moss-bed reactor, it was possible to cultivate S. palustre, as well as the two other moss species S. rubellum and S. fimbriatum, which grew slowly in submerged culture in batch processes, emerse and axenic. Under continuous illumination at a PFD of 200 μmol·m-2·s-1, with an aeration rate of 25 ml∙min-1 and carbon dioxide concentration of xCO2=2 % in gas mixture, S. palustre achieved an average length growth rate of 0.17 cm·d-1, S. rubellum of 0.09 cm·d-1, and S. fimbriatum of 0.20 cm·d-1. The culture medium with a volume of 800 ml was 0.2 fold Knop-Medium containing 0.25 mmol·l-1 NH4NO3 and extended by 0.216 g∙l-1 Mg(NO3)2 to avoid chlorophyll degradation in the upper moss layers. Under these conditions, The moss-bed reactor showed a high area productivity of 12.6 gDW∙m-2∙d-1 (312 gFW∙m-2∙d-1) compared to field mosses. With the developed reactor system, it was possible to grow the mosses in a compact moss carpet with a differentiated growth habit. The moss-bed reactor opens an access to the cost-effective production of peat moss biomass with nearnatural morphology because of the low operating costs, which are determined only by the aeration for gas supply. In addition, the moss-bed reactor has the upscaling potential by stacking identical reactor stages.
Subsequently, this work focused on the production of peat moss biomass with many innovations and capitula at laboratory-scale because this morphology has been found to be best for seeding material. In a horizontally operated 5 L wave photobioreactor, the volumetric productivity was 2.8 gFW∙l-1∙d-1 and S. palustre grew in spherical growth habit with many innovations. Despite the suitable seed quality, this type of reactor is not suitable for large scale production of peat mosses due to the limited scale-up and the high operating costs caused by mixing. The second alternative of a submerged cultivation system for scale-up was the vertically constructed 60 L tubular reactor from microalgae cultivation. In the reactor, S. palustre grew under constant emperature, in hygienised operation in which the medium (i organic 1.0fold Knop-Medium containing 1.25 mmol·l-1 NH4NO3) was not pre-autoclaved. The tubular reactor produced peat moss biomass with many capitula under continuous illumination with an LED lighting module consisting of cool white LEDs, at a PFD=200 μmol·m-2·s-1, with aeration rate of 0.03 vvm containing 2 % CO2. Since there was much less turbulence in the tubular reactor, loose moss structures were produced. However, the achieved productivity of 0.02 gDW∙L-1∙d-1 (0.43 gFW∙L-1∙d-1) was low because the peat mosses experienced strong buoyancy due to the gas bubbles and thus did not use the entire lighting area for growth. Despite the fact that the tube reactor proved to be unsatisfactory in terms of productivity, this type of reactor should be pursued for peat moss biomass production. First, the tubular reactor is fundamentally different from existing submerged photobioreactors, where scale-up is not technically feasible. The increase in production capacity can be realized by placing the individual tube reactors side by side without negatively affecting the light conditions in the reactor. Secondly, volumetric productivity can be increased by improved axial mixing and partial harvest of the produced moss biomass.
It was shown, that S. palustre is able to grow in different reactor types and all three reactor types tested are suitable for small-scale production of peat moss biomass. Thus, larger scale cultivation should be feasible. The different hydrodynamic condition in the photobioreactors cause variations in peat moss morphology, which are probably explained by the exposure to the light and gravity in the first case and to the rotation, buoyancy in the second case. Depending on the desired quality of the seed, the three presented photobioreactors can be further designed and used for up-scaling for future industrial peat moss production.
