Ein effizienteres Herstellungsverfahren für Liposomen aus Wasser-in-Fluorocarbon Nanoemulsionen

Die Verabreichung von Wirkstoffen ohne einen vorzeitigen Abbau im Körper stellt in manchen pharmazeutischen Anwendungen eine Herausforderung dar. Untersuchungen von verschiedenen Transportsystemen wie Liposomen nehmen sich dieser Problematik an. Liposomen sind kugelförmige Vesikel, die aus einer Phospholipiddoppelschicht bestehen und Bestandteil von natürlichen Membranen sind. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und der Analyse eines neuen Herstellungsprozesses von Liposomen aus Wasser-in-Fluorocarbon Nanoemulsionen für die pharmazeutische Anwendung. ... mehrDer neue Prozess kommt ohne die Verwendung von organischen Lösungsmitteln aus, sodass eine aufwendige Entfernung entfällt. Im Fokus der Arbeit liegen drei Schwerpunkte, die den wesentlichen Bestandteil des Prozesses ausmachen: Die Auswahl des passenden Stoffsystems, deren Charakterisierung mit geeigneten Analysemethoden und die Herstellung sowie Einkapselungseffizienz von Liposomen.
Der erste Schwerpunkt liegt in der tensiometrischen Wechselwirkung zwischen der wässrigen und hydrophoben Phase. Als hydrophobe Phase kommt das Perfluorocarbon Perfluoroperhyd-rophenanthren zum Einsatz, welches aufgrund seiner inerten Eigenschaften für die pharmazeutische Anwendung zunehmend an Bedeutung gewinnt. An der Grenzfläche zwischen dem Perfluorocarbon und der wässrigen Phase lagern sich diffusionskontrolliert verschiedene Phospholipide an, die im Transferprozess als Baustein für die Doppelschicht der Liposomen dienen.
Herausfordernd ist die Bestimmung der Grenzflächenspannung zwischen beiden Phasen, da hohe Dichteunterschiede und fast identische Brechungsindizes den Einsatz von visuellen Methoden wie der Tropfenprofilanalyse unmöglich machen. Gegensätzlich der zeitintensiven, nicht-invasiven Spinning Drop Tensiometrie liefert die invasive Du Noüy-Ring Methode effizienter reproduzierbare Ergebnisse.
Die Analyse der Grenzflächen zwischen verschiedenen Phospholipid-Suspensionen und der hydrophoben Phase zeigt, dass die Dauer zum Erreichen der Gleichgewichts-Grenzflächenspannung mit zunehmender Länge der Fettsäurekette zunimmt. Dies zeigt sich insbesondere bei der minimal erreichbaren Grenzflächenspannung. Auch der Temperaturbe-reich beeinflusst den Adsorptionsprozess, da sich oberhalb der Übergangstemperatur der jeweiligen Phospholipide der Anlagerungsprozess an die Grenzfläche beschleunigt und Unterschiede zwischen den Fettsäureketten nicht mehr auszumachen sind.
Im zweiten Abschnitt erfolgt die Herstellung der Nanoemulsionen über die Ultraschallemulgierung mit anschließender Tropfengrößenanalyse. Ähnliche Brechungsindizes zwischen hydrophober und hydrophiler Phase erschweren die Messung der Nanoemulsionströpfchen mittels dynamischer Lichtstreuung. Aufgrund des Eintrags von Gasblasen in das System ist der anzahlgewichtete Durchmesser als Vergleichswert direkt nach der Herstellung zu bevorzugen. Langzeitanalysen zeigen, dass unabhängig vom verwendeten Phospholipid eine Langzeitstabi-lität von mehreren Wochen bei einer Größe von < 200 nm zu erreichen ist. Die Ergebnisse mit Perfluoroperhydrophenanthren und der Vergleich mit anderen Fluorocarbonen zeigen, dass die Eigenschaften des Stabilisators weniger ins Gewicht fallen als die Eigenschaften des Fluorocarbons selbst. Eine geringere Dichte der hydrophoben Phase führt zu größeren Tropfen und einer höheren Polydispersität der Nanoemulsionen.
Da die Tropfengröße der Nanoemulsionen im Zielbereich liegt, ist der Transfer zur Liposo-men-Herstellung als zweiter Verfahrensschritt möglich. Durch den Transfer entstehen Liposomen mit einer mittleren Größe von etwa 60 nm, welche sowohl mit der dynamischen Lichtstreuung als auch der Röntgenkleinwinkelstreuung gemessen sind.
Fluoreszein-Natrium, Rinderserumalbumin und Fluoreszenz-markiertes Dextran kamen als Modellwirkstoffe zum Einsatz. Als Nachweismethode für deren Einkapselungseffizienzen dient die UV-Vis Spektroskopie. Unter Verwendung von Reinstwasser als hydrophile Phase und Fluoreszein-Natrium als niedrigmolekularem Wirkstoff ist eine Einkapselungseffizienz von bis zu 99% zu erreichen. Die hochmolekularen Modellwirkstoffe Rinderserumalbumin und Dextran erreichen eine Effizienz von bis zu 89% bzw. 98%. Der Zusatz von Salzen in der wässrigen Phase verschlechtert die Einkapselungseffizienz. Ebenso führen unterschiedliche osmotische Bedingungen innerhalb und außerhalb des Liposoms zu einem höheren Verlust der Markersubstanzen. Analog zur Herstellung von Nanoemulsionen zeigt sich, dass auch bei der Einkapselung Fluorocarbone mit einer geringeren Dichte weniger effizient Wirkstoffe einschließen. Die höchsten Einkapselungseffizienzen lassen sich mit einer Phospholipidkon-zentration zwischen 150 mM und 300 mM erzielen, während die Zugabe von Cholesterin als natürlicher Membranbestandteil eine Verschlechterung hinsichtlich der Einkapselungseffizienz bewirkt.
Mit Perfluoroperhydrophenanthren als hydrophobem Phasenanteil gelingt die Herstellung stabiler Wasser-in-Fluorocarbon Nanoemulsionen. Der verfahrenstechnische Zentrifugationsprozess erlaubt die Produktion von Liposomen mit hohem Einkapselungsvermögen für verschiedene Wirkstoffe.

The delivery of active ingredients without premature degradation in the body is a challenge in some pharmaceutical applications. Studies of various transport systems such as liposomes are addressing this issue. Liposomes are spherical vesicles composed of a phospholipid bilayer and are part of natural membranes. The present work deals with the development and analysis of a new manufacturing process of liposomes from water-in-fluorocarbon nanoemulsions for pharmaceutical applications. The new process does not require the use of organic solvents, eliminating the need for time-consuming removal. ... mehrThe work focuses on three key aspects that make up the essential part of the process: The selection of the appropriate material system, their characterization with suitable analytical methods, and the production and encapsulation efficiency of liposomes.
The first focus is on the tensiometric interaction between the aqueous and hydrophobic phases. The hydrophobic phase used is the perfluorocarbon perfluoroperhydrophenanthrene, which is becoming increasingly important for pharmaceutical applications due to its inert properties. At the interface between the perfluorocarbon and the aqueous phase, various phospholipids accumulate in a diffusion-controlled manner and serve as building blocks for the bilayer formation of liposomes during the transfer.
Determining the interfacial tension between the two phases is challenging because high density differences and nearly identical refractive indices make it impossible to use visual methods such as drop profile analysis. In contrast to the time-consuming, non-invasive spinning drop tensiometry, the invasive Du Noüy ring method provides more efficient reproducible results.
The analysis of the interfaces between different phospholipid suspensions and the hydrophobic phase shows that the time to reach the equilibrium interfacial tension increases with increasing fatty acid chain lengths. This also holds for approaching the minimum interfacial tension. The temperature regime has a strong influence on the adsorption process: above the transition temperature of the respective phospholipids, the adsorption at the interface accelerates and differences between the chain lengths of phospholipids can no longer be detected.
In the second section, the preparation of the nanoemulsions is carried out via ultrasonic emulsification followed by droplet size analysis. Similar refractive indices between hydrophobic and hydrophilic phases complicate the measurement of nanoemulsion droplets by dynamic light scattering. Due to the occurrence of gas bubbles within the system, the number mean diameter is preferred as a comparative quantity immediately after preparation. Long-term analyses show that independent of the used phospholipid, a long-term stability of several weeks can be achieved at a size < 200 nm. The results with perfluoroperhydrophenanthrene and the comparison with other fluorocarbons show that the properties of the stabilizer are less important than the properties of the fluorocarbon itself. A lower density of the hydrophobic phase leads to larger droplets and increased polydispersity of the nanoemulsions.
Since the investigated nanoemulsions have the desired droplet size, transfer to liposome production is subsequently possible. The transfer results in liposomes with an average size of about 60 nm, which are measured by both dynamic light scattering and small-angle X-ray scattering.
Fluorescein sodium, bovine serum albumin and fluorescently labeled dextran were used as model agents. UV-Vis spectroscopy was used as a detection method for their encapsulation efficiencies. Using ultrapure water as the hydrophilic phase and fluorescein sodium as the low molecular weight drug, an encapsulation efficiency of up to 99% can be achieved. The high molecular weight model drugs bovine serum albumin and dextran achieve efficiencies of up to 89% and 98%, respectively. The addition of salts in the aqueous phase worsens the encapsula-tion efficiency. Similarly, different osmotic conditions inside and outside the liposome lead to a higher loss of the marker substances. Encapsulation experiments also confirm the observation that fluorocarbons with a lower density entrap a lower amount of the drug. The highest encapsulation efficiencies can be obtained with a phospholipid concentration between 150 mM and 300 mM, while the addition of cholesterol as a natural membrane component causes deterioration regarding the encapsulation efficiency.
With perfluoroperhydrophenanthrene as the hydrophobic phase component, it is possible to produce stable water-in-fluorocarbon nanoemulsions. The centrifugation process leads to liposomes with high encapsulation capacity for various active ingredients.