Additive Manufacturing in Biotechnology : Methods, Inks and Analytics for Biocatalytic Applications of Extrusion-Based 3D Bioprinting

In den letzten zehn Jahren hat sich die Additive Fertigung (AM) von einer spezialisierten Nischenanwendung zu einem weit verbreiteten Standardwerkzeug entwickelt, das in vielen Bereichen der Forschung und Industrie unverzichtbar geworden ist. Dank neuer Technologien und Materialien, die die Herstellung hochwertiger Produkte ermöglichen, ist AM nicht nur für das schnelle Anfertigen von Prototypen relevant, sondern auch für die Herstellung von Produkten für Endverbraucher. Vor allem bei Produkten mit hohem Bedarf für kundenspezifische Anpassungen oder bei Produkten mit hoher geometrischer Komplexität können AM-Methoden als sinnvolle Alternative zu anderen Fertigungsverfahren in Betracht gezogen werden. ... mehrIn der Medizin und Bioverfahrenstechnik wird AM typischerweise für Anwendungen wie die Herstellung von Zahnimplantaten und Zahnschienen oder für maßgeschneiderte Laborgeräte, mikrofluidische Systeme und sogar Chromatographiesäulen eingesetzt. Die Kombination von biologischen Materialien und lebenden Zellen mit AM-Methoden hat dazu geführt, dass sich das Bioprinting als eigenständiger Bereich mit neuen Möglichkeiten und Herausforderungen etabliert hat. Bioprinting-Methoden ermöglichen die Herstellung von Objekten aus weichen, wasserbasierten Materialien, die sich für den physikalischen Einschluss von Enzymen eignen. Dadurch können biokatalytische Reaktoren direkt mit enzymhaltigen Tinten gedruckt werden.
Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, neue Werkzeuge für die Herstellung biokatalytisch aktiver Materialien zu schaffen, wobei der Schwerpunkt auf extrusionsbasiertem Bioprinting liegt. Neuartige Tinten werden in Kombination mit speziell angepassten Druckmethoden etabliert, um eine verbesserte Druckbarkeit zu erreichen. Um die Eignung der verschiedenen Materialien hinsichtlich der resultierenden biokatalytischen Aktivität zu bewerten, werden mikroplattenbasierte Aktivitätsassays mit zwei verschiedenen Enzymen und einer Reihe von 3D-gedruckten Materialien durchgeführt. Die Tinten und Hydrogele werden mit einer Reihe weiterer Analysemethoden wie Rheologie, mechanischen Tests oder Rasterelektronenmikroskopie charakterisiert. Um die Durchlässigkeit von Hydrogelen für Substratmoleküle zu bestimmen, wird eine auf Mikrofluidik basierende Methode zur Abschätzung von Diffusionskoeffizienten in Hydrogelen entwickelt. Als allgemeiner Beitrag zur Verbesserung der Prozessüberwachung und -steuerung beim extrusionsbasierten Bioprinting wird eine PID-basierte Drucksteuerung etabliert, um einen konstanten und reproduzierbaren Tintenfluss zu erzeugen.
In einer ersten Studie wurde ein neuartiges Materialsystem für das Drucken enzymatisch aktiver Strukturen etabliert, indem hochkonzentrierte Emulsionen (high internal phase emulsions -- HIPEs) als Tinten verwendet wurden. HIPEs sind Emulsionen, die mindestens 74 % (v/v) an innerer Phase enthalten, was der dichtesten möglichen Packung von Tröpfchen entspricht, bevor eine Verformung eintritt. Als äußere Phase der HIPEs wurden polymerisierbare ölige Monomere verwendet und der wässrigen inneren Phase wurden Poly(ethylenglycol)diacrylat und Acrylsäure zugesetzt. Auch öl- bzw. wasserlösliche Photoinitiatoren wurden den jeweiligen Phasen zugesetzt. Die Polymerisation der Tinten führte zur Bildung eines offenporigen Polymergerüsts, das mit untereinander vernetzten Hydrogeltröpfchen gefüllt ist. Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung von Kompositmaterialien mit hydrogelähnlichen Eigenschaften wie der Durchlässigkeit für Substrat- und Produktmoleküle bei gleichzeitig höherer mechanischer Stabilität aufgrund der stützenden Wirkung des Polymergerüsts. Tinten für den extrusionsbasierten 3D-Druck als Emulsionen zu formulieren bringt deutliche Vorteile hinsichtlich der rheologischen Eigenschaften der Tinten, da Emulsionen aufgrund ihrer Fließgrenze ideal für Extrusionsdruck geeignet sind. Um die Herstellung kleiner Volumina von HIPEs zu ermöglichen, wurde ein maßgeschneiderter Aufbau auf der Grundlage eines 3D-gedruckten spiralförmigen Rührblatts entwickelt, der die Herstellung von HIPEs in 50-mL-Falcon-Röhrchen ermöglichte. Durch die Minimierung von Materialverlust erlaubte die Produktion in kleinem Maßstab die Zugabe des Enzyms β-Galactosidase. Rheologische Messungen mit einer Reihe verschiedener HIPE-Zusammensetzungen zeigten, dass HIPEs mit einem hohen Anteil an Tensid in der äußeren Phase und mit einem hohen Volumenanteil an innerer Phase eine höhere Fließgrenze aufwiesen, was als Indikator für Druckbarkeit gilt. Im Allgemeinen wiesen die hergestellten HIPEs hervorragende rheologische Eigenschaften auf. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass sowohl die äußere, als auch die innere Phase der HIPEs polymerisiert werden konnte. Ein Versuchsaufbau mit vier um die Extrusionskanüle des Biodruckers herum angeordneten UV-LEDs wurde entwickelt, um die Polymerisation der Tinten während der Extrusion zu ermöglichen, was das Zerlaufen des Materials reduziert und so die Druckqualität weiter verbessert. Es wurden Hohlzylinder mit enzymhaltiger Tinte gedruckt, um Aktivitätsmessungen in 48-Well-Mikroplatten durchzuführen. Die Ergebnisse zeigten, dass die HIPEs biokatalytisch aktiver waren, wenn sie große Mengen an Monomer in der wässrigen Phase und einen hohen Volumenanteil an wässriger Phase enthielten. Die Anwesenheit von mindestens 7 % (v/v) Monomer in der wässrigen Phase führte zu einer mehr als fünffachen Steigerung der gemessenen Aktivität im Vergleich zu HIPEs ohne Monomer in der wässrigen Phase. Der Durchmesser der Extrusionskanüle konnte als weiterer wichtiger Parameter identifiziert werden, der die resultierende Aktivität beeinflusst. Diese Beobachtung könnte auf die durch das Trägermaterial bedingte Verringerung des Stofftransports zurückzuführen sein, die ein hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen allgemein vorteilhaft macht.
Um ein breiteres Spektrum an Tintentypen abzudecken, wurden in der zweiten und dritten Studie dieser Arbeit Tinten auf der Basis von Agarose und Agar untersucht. Diese Tinten wiesen im Vergleich zu HIPEs deutlich andere Materialeigenschaften auf, sowohl im flüssigen Zustand als Tinte, als auch im verfestigten Zustand als Hydrogel. Um den Anforderungen dieser Tinten gerecht zu werden, wurden der Versuchsaufbau für den Druck und die eingesetzten Analyseverfahren speziell an die untersuchten Tinten angepasst. Die Durchlässigkeit für Substrat- und Produktmoleküle wurde als eine der wichtigsten Eigenschaften der Materialien hinsichtlich ihrer Eignung für die Immobilisierung von Enzymen identifiziert. Daher wurde eine auf Mikrofluidik basierende Methode zur Schätzung des Diffusionskoeffizienten eines Analyten in transparenten Hydrogelen entwickelt. Ein mikrofluidischer Chip mit drei Einlässen und einer Y-Verzweigung wurde verwendet, um eine Grenzfläche zwischen dem zu untersuchenden Hydrogel und einer Analytlösung zu schaffen. Zu diesem Zweck wurde flüssige Tinte bei erhöhter Temperatur von einer Seite in den Chip injiziert, bis sie die Y-Verzweigung erreichte. Nach dem Ausgelieren der Tinte wurde die Analytlösung durch einen der anderen Einlässe injiziert und die Diffusion des Analyten durch das Hydrogel wurde mit einem UV-Flächendetektor überwacht. Die Diffusionskoeffizienten konnten durch das Fitten der gemessenen Konzentrationsprofile des Analyten entlang des mikrofluidischen Kanals mit einer analytischen Lösung des zweiten Fick'schen Diffusionsgesetzes geschätzt werden. In einer Fallstudie wurde der Diffusionskoeffizient von Lysozym in einer Reihe von Hydrogelen bestimmt und verglichen. Die untersuchten Hydrogele bestanden aus unterschiedlichen Konzentrationen von unmodifizierter Agarose bzw. modifizierter Hydroxyethylagarose mit niedrigem Schmelzpunkt. Es wurde festgestellt, dass der Diffusionskoeffizient von 5(6)-Carboxyfluorescein in unmodifizierten Agarosehydrogelen etwas höher war als in Agarosehydrogelen mit niedrigem Schmelzpunkt. Dies stimmt gut mit der theoretischen Vorhersage überein, dass das Polymernetzwerk von Hydrogelen aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt kleinere Porengrößen aufweist. Der gleiche Trend wurde für die Polymerkonzentration festgestellt, wobei höhere Konzentrationen mit niedrigeren Diffusionskoeffizienten und kleineren Poren einhergingen.
In einer dritten Studie wurden Tinten auf Basis von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Agar als weniger komplexe Alternative zu Tinten auf HIPE-Basis untersucht. Das Gelierungsverhalten von Agarose- und Agarbasierten Tinten erforderte einen anderen Versuchsaufbau für den Druck als die photopolymerisierbaren HIPEs. Eine beheizbare Düse, bestehend aus einem 3D-gedruckten Metallkörper, einem Temperatursensor und einem Heizdraht, wurde in den Aufbau implementiert, um sicherzustellen, dass die Tinten in flüssigem Zustand bei einer definierten Temperatur extrudiert werden konnten. Die Tinten wurden auf ein gekühltes Substrat extrudiert, um den Gelierungsprozess zu beschleunigen und das Zerlaufen der Tinte zu reduzieren. Obwohl das individuell an die Tinten angepasste Equipment die Druckbarkeit im Vergleich zu früheren Studien mit agarosebasierten Tinten deutlich verbesserte, war sie der Druckbarkeit von HIPEs immer noch drastisch unterlegen, sowohl hinsichtlich der erzeugten Strangdicke, als auch bzgl. der erreichbaren geometrischen Komplexität. Es konnten nur einfache Gitterstrukturen ohne Überhänge gedruckt werden. Eine Polymerkonzentration von mindestens 4,5 % (w/w) erwies sich als vorteilhaft für den Druck, wobei Gitterstrukturen mit einer Höhe von 2 cm druckbar waren. Mit rheologischen Methoden wurden die Tinten auf ihre Fließeigenschaften sowie ihr Schmelz- und Gelierverhalten untersucht. Die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt zeigte im Vergleich zu den Agartinten wie erwartet deutlich reduzierte Gelier- und Schmelztemperaturen. Die verfestigten Hydrogele wurden einer mechanischen Prüfung unterzogen. Eine Reihe der in den vorherigen Studien etablierten Analysemethoden wurden erneut angewandt, um die Hydrogele auf Agarose- und Agarbasis im Hinblick auf ihre Anwendung für die Immobilisierung von Enzymen zu bewerten. Zu diesem Zweck wurde den Tinten vor dem Druck das thermostabile Enzym Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius zugegeben. Zur Messung der enzymatischen Aktivität und des Auswaschens von Enzym aus den gedruckten Hydrogelproben wurden mikrotiterplattenbasierte Aktivitätsassays verwendet. Die mikrofluidikbasierte Methode zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten wurde eingesetzt, um die Durchlässigkeit der Hydrogele für 5(6)-Carboxyfluorescein zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die agarbasierten Hydrogele eine höhere Diffusionsfähigkeit und Aktivität aufwiesen, aber auch eine erhöhte Auswaschung von Enzym. Die Tendenz zum Auswaschen des Enzyms zeigte nicht nur die mangelnde Eignung von agarbasierten Hydrogelen für den Einsatz in durchströmten Reaktoren, sondern erklärt auch die scheinbar positiven Ergebnisse bei den durchgeführten Aktivitätsassays, da das ausgewaschene Enzym nicht mehr denselben Stofftransportbeschränkungen ausgesetzt ist wie immobilisiertes Enzym und dadurch eine höhere Aktivität aufweist. Aufgrund der geringen Auswaschung von Enzym und der akzeptablen Druckbarkeit wurden Agarosetinten mit einer Konzentration von mindestens 4,5 % (w/w) als geeignete Tinten für die Anwendung in biokatalytischen Reaktoren empfohlen.
Unabhängig vom Tintentyp zeigten die bisherigen Studien einen allgemeinen Mangel an Reproduzierbarkeit bei pneumatischen Bioprinting-Verfahren, der auf schwankende und schlecht reproduzierbare Flussraten bei der Extrusion der Tinten zurückzuführen ist. Es wurde vermutet, dass neben der Viskosität der Tinte und dem Extrusionsdruck noch zusätzliche Faktoren wie der Füllstand der Kartusche, die teilweise Verstopfung der Düsen und Inhomogenitäten der Tinte die Extrusionsflussrate beeinflussen und Unregelmäßigkeiten in den Druckergebnissen verursachen. Unterschiede zwischen verschiedenen Tintenchargen und Temperaturschwankungen, die die Viskosität der Tinte beeinflussen, stellten eine zusätzliche Herausforderung dar. In der Studie zu agarose- und agarbasierten Tinten wurde jede gedruckte Probe gewogen, bevor sie für Aktivitätsmessungen verwendet wurde, und verworfen, wenn sie das vorgegebene Zielgewicht nicht innerhalb einer bestimmten Fehlertoleranz erreichte. Falls erforderlich, wurde der Extrusionsdruck manuell angepasst, um die Vergleichbarkeit der gedruckten Proben zu gewährleisten. Infolgedessen wurde eine Studie initiiert, um eine Inline-Prozessüberwachung für die Durchflussrate als wesentlichen Prozessparameter zu etablieren und eine automatisierte und reproduzierbare Methode zu entwickeln, um eine konstante Zielflussrate zu erzeugen, indem der Extrusionsdruck auf der Grundlage von Echtzeitflussdaten kontinuierlich angepasst wird. Um die benötigten Daten in einer Inline-Messung zu erhalten, wurde ein Durchflusssensor in den Aufbau eines pneumatischen Biodruckers mittels einer 3D-gedruckten Halterung integriert. Für die Kommunikation mit dem Flusssensor und die Verarbeitung der gemessenen Daten wurde ein auf Python basierendes Softwaretool entwickelt. Eine PID-Regelung wurde implementiert und mit den Echtzeit-Durchflussdaten gespeist. Auf Grundlage der eingespeisten Daten passte die Software den Extrusionsdruck des Druckers kontinuierlich an. Es wurden drei verschiedene Fallstudien durchgeführt, um die Leistung der PID-Regelung zu bewerten:
a) Kontinuierliche Extrusion: Mehrere Durchläufe mit kontinuierlicher Extrusion zeigten, dass die automatische Druckanpassung erfolgreich eine vorgegebene Zielflussrate unabhängig vom Benutzer einstellen konnte. Im Vergleich zur konstanten Druckeinstellung erwies sich die adaptive Druckregelung als effektiv bei der Kompensation von umwelt- oder systembedingten Einflüssen wie Verstopfungen der Extrusionskanüle. b) Anpassung an Tinteninhomogenitäten: Ein realistischerer Anwendungsfall wurde untersucht, indem Hohlzylinder mittels einer Kartusche gedruckt wurden, die mit Schichten aus zwei unterschiedlich konzentrierten Poloxamer-407-Tinten gefüllt war, um Tinteninhomogenitäten zu simulieren. Die adaptive Druckregelung erwies sich als wirksam, eine konstante Durchflussrate zu erzeugen, indem der Druck während des Druckvorgangs entsprechend angepasst wurde. Dadurch konnten relativ gleichmäßige Zylinder gedruckt werden, während die konstante Druckeinstellung zu Zylindern mit stark voneinander abweichenden Wandstärken führte. c) Prozessübertragung auf andere Düsentypen: Um die Übertragbarkeit von Prozessen zwischen verschiedenen Versuchsaufbauten zu demonstrieren, wurden Testdrucke mit drei verschiedenen Typen von Extrusionskanülen mit gleichem Öffnungsdurchmesser durchgeführt. Die adaptive Druckregelung war in der Lage, mit allen drei Extrusionskanülen innerhalb von 30 bis 60 s die gewünschte Zielflussrate zu erzeugen. Die resultierenden Zylinder waren von gleichbleibender Qualität, unabhängig von der Kanüle. Beim Drucken mit konstanter Druckeinstellung wurde entweder zu wenig oder zu viel Tinte extrudiert, wenn der Druck nicht speziell für den entsprechenden Typ von Kanüle festgelegt wurde. Es wurde gezeigt, dass die PID-gesteuerte adaptive Druckregelung dazu beitragen kann, das extrusionsbasierte Bioprinting zuverlässiger zu machen und die Notwendigkeit umfangreicher Parameter-Screenings bei der Prozessentwicklung zu verringern.
Die vorliegende Arbeit demonstriert neue Methoden für das Drucken von biokatalytisch aktiven Materialien. Es werden neuartige Tinten mit individuell angepassten Druckverfahren und analytischen Techniken vorgestellt. Die Anwendung von emulsionsbasierten Tinten zeigt die große Bandbreite an Materialien, die in Kombination mit Enzymen eingesetzt werden können. Materialscreenings können durch den Einsatz von Aktivitätsassays im Mikrotiterplattenformat beschleunigt werden. Die speziell für jede Tintenart angepassten Druckmethoden zeigen die Notwendigkeit einer Feinabstimmung zwischen Tinte und Druckverfahren. Der universelle Ansatz zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit im pneumatischen Bioprinting unter Verwendung einer PID-basierten Druckregelung könnte auch für Anwendungen außerhalb der Biokatalyse von Nutzen sein.

In the last decade, Additive Manufacturing (AM) has evolved from a specialized niche application to a widely used standard tool that has become indispensable in many areas of research and industry. Due to new technologies and materials enabling the fabrication of high quality products, AM is not only relevant for Rapid Prototyping, but also in the fabrication of products for end users. Especially when a high degree of customization or geometrical complexity is involved, AM methods can be considered as viable options. In medicine and biochemical engineering, AM is typically employed for applications like the fabrication of dental implants and mouthguards or for customized lab equipment, microfluidic devices and even chromatography columns. ... mehrThe combination of biological materials and living cells with AM methods has resulted in the establishment of bioprinting as a separate field with new opportunities and challenges. Bioprinting methods allow the fabrication of soft, water-based materials suitable for the physical entrapment of enzymes. This allows biocatalytic reactors to be directly printed using enzyme-loaded inks.
The present thesis aims at extending the toolbox for the fabrication of biocatalytically active materials with a focus on extrusion-based bioprinting. Novel inks are established in combination with specifically adapted printing setups to achieve enhanced printability. To assess the performance of different materials regarding the resulting biocatalytic activity, microplate-based activity assays are established for two different enzymes. The inks and hydrogels are characterized using a range of additional analytical methods like rheology, mechanical testing or scanning electron microscopy. To determine the permeability of hydrogels for substrate molecules, a microfluidics-based method for the estimation of diffusion coefficients in hydrogels is developed. As a general contribution to the improvement of process monitoring and control in extrusion-based bioprinting, a PID-based pressure control is established to generate a constant and reproducible ink flow.
In an initial study, a novel material system for the printing of enzymatically active structures was established by employing high internal phase emulsions (HIPEs) as inks. HIPEs are emulsions that contain at least 74 % (v/v) of internal phase which corresponds to the densest possible packing of droplets before deformation occurs. Polymerizable oily monomers were used as the external phase of the HIPEs and poly(ethylene glycol) diacrylate and acrylic acid were added to the aqueous internal phase. Oil- and water-soluble photoinitiators were added to the respective phases, as well. Polymerizing these inks resulted in the formation of an open-porous polymer scaffold filled with an interconnected hydrogel. This approach enables the fabrication of composite materials with hydrogel-like properties like the diffusibility for substrate and product molecules, while exhibiting higher mechanical stability due to the supportive effect of the polymer scaffold. Also, the formulation of inks as emulsion results in rheological properties favorable for extrusion-based printing. To allow the production of small HIPE batches, a customized setup was established based on a 3D-printed helical stirrer blade that allowed the production of HIPEs in 50 mL Falcon tubes. The small scale production allowed adding the enzyme β-galactosidase to the aqueous phase by minimizing material waste. Rheological measurements with a range of different HIPE compositions showed that HIPEs with a high amount of surfactant in the external phase and with a high volume fraction of inner phase displayed higher yield stress values which correlate with printability. In general, the produced HIPEs displayed excellent rheological properties. Electron scanning microscopy showed that both the external and internal phase of the HIPEs could be polymerized. A cure-on-dispense setup with four UV LEDs was developed to allow the polymerization of the inks during extrusion which reduced ink spreading and improved printing quality further. Hollow cylinders of enzyme-containing inks were printed to perform activity assays in 48-well microplates. The results showed that the HIPEs were more biocatalytically active when they contained high amounts of monomer in the aqueous phase and a high aqueous phase volume fraction. The presence of at least 7 % (w/w) monomer in the aqueous phase caused a more than fivefold increase in measured activity compared to HIPEs without monomer in the aqueous phase. The diameter of the printer nozzle could be identified as another important parameter influencing the resulting specific activity. This observation could be attributed to the mass transfer limitations caused by the matrix material which makes high surface-area-to-volume ratios favorable.
To cover a wider range of ink types, the second and third study of the thesis aimed at investigating inks based on agarose and agar. These inks demonstrated very different material properties compared to HIPEs, both in a fluid state as inks and in a solidified state as hydrogels. To adapt to the requirements of these inks, the hardware of the printing setup and the employed analytical techniques were again specifically adapted to the investigated inks. Diffusibility for substrate and product molecules was identified as one of the most important properties of the materials regarding their suitability for the immobilization of enzymes. Thus, a microfluidics-based method to estimate the diffusion coefficient of an analyte within transparent hydrogels was established. A microfluidic chip with three inlets and a y-junction was employed to create an interface between the hydrogel to be investigated and an analyte solution. For that purpose, liquid ink was injected at elevated temperature into the chip from one side, until it reached the y-junction. After the gelation of the ink, the analyte solution was injected through one of the other inlets and the diffusion of the analyte through the hydrogel was monitored using a UV area imaging system. Diffusion coefficients could be estimated by fitting the obtained analyte concentration profiles along the microfluidic channel with an analytical solution of Fick's second law of diffusion. As a case study, the diffusion coefficient of lysozyme was compared in a range of hydrogels made from different concentrations of unmodified agarose and low-melt hydroxyethyl agarose. It was found that the diffusion coefficient of 5(6)-carboxyfluorescein was slightly higher in unmodified agarose hydrogels compared to low-melt agarose hydrogels. This aligns well with the theoretical prediction that the polymer networks of low-melt agarose hydrogels exhibit smaller pore sizes. The same trend was found for polymer concentration where higher concentrations were associated with lower diffusion coefficients and smaller pores.
In a third study, inks based on low-melt agarose and agar were investigated as a less complex alternative to HIPE-based inks. The thermogelling behavior of agarose- and agar-based inks required a different printing setup than the photopolymerizable HIPEs. A heatable nozzle consisting of a 3D-printed metal body, a temperature sensor and a heating filament was implemented in the printer setup to ensure that the inks could be extruded in a liquid state at a defined temperature. The setup also drastically reduced nozzle clogging. The inks were extruded onto a cooled substrate to accelerate the gelation process and reduce ink spreading. While the customized setup enhanced printability significantly compared to previous studies with agarose-based inks, it was still drastically inferior to the printability of HIPEs, both regarding strand thickness and achievable complexity like overhangs. Only basic grid structures without overhangs could be printed. A polymer concentration of at least 4.5 % (w/w) was found to be beneficial for printing and grid structures of 2 cm in height could be fabricated. Using rheological methods, the inks were analyzed for their flow properties and their melting and gelling behavior. The low-melt agarose showed drastically reduced gelling and melting temperatures compared to the agar inks. The solidified hydrogels were subjected to mechanical testing. A set of analytical methods established in the previous studies was reapplied to evaluate the agarose- and agar-based hydrogels with regards to their application in enzyme immobilization. For that purpose, the thermostable enzyme esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius was added to the liquid inks before printing. Microplate-based activity assays were used to analyze the enzymatic activity and leaching behavior of printed hydrogel samples, while the microfluidics-based method was employed to determine the diffusibility of the hydrogels for 5(6)-carboxyfluorescein, the product of the reaction catalyzed by esterase 2 in the employed activity assay. It was found that the agar-based hydrogels showed higher diffusibility and activity, but also increased enzyme leaching. The tendency for enzyme leaching not only demonstrated the lacking suitability of agar-based hydrogels for the employment in perfused reactors, it also explains the seemingly positive results in the performed activity assays, as leached enzyme is not exposed to the same mass transfer limitations as immobilized enzyme resulting in enhanced observed activity. Due to their low enzyme leaching and acceptable printability, agarose inks with a concentration of at least 4.5 % (w/w) were recommended as suitable inks for the application in biocatalytic reactors.
Independent of ink type, the previous studies revealed a general lack of reproducibility in pneumatically driven bioprinting caused by unsteady and poorly reproducible ink flow rates. Besides ink viscosity and extrusion pressure, additional factors like cartridge fill level, partial nozzle clogging and ink inhomogeneities were suspected to influence the extrusion flow rate and cause imperfections in the resulting prints. Batch-to-batch variations and temperature fluctuations influencing the ink viscosity posed additional challenges. In the study investigating agarose- and agar-based inks, every printed sample was weighed before being used for activity assays and discarded if it did not comply with the set target weight within a specified margin of error. When necessary, the extrusion pressure was manually adapted to ensure the comparability of the printed samples. As a consequence, a study was initiated to establish in-line process monitoring of the ink flow rate as an essential process parameter and to develop an automated and reproducible method to generate a constant target flow rate by continuously adapting the extrusion pressure based on real-time flow rate data. To obtain the required data in an in-line measurement, a liquid flow meter was integrated into the setup of a pneumatically driven bioprinter using a 3D-printed mount. A Python-based software tool was developed to communicate with the flow sensor and to process the data input. A PID loop was implemented and fed with the real-time flow rate data. Based on the data input, the software continuously adapted the extrusion pressure of the printer. Three different case studies were performed to assess the performance of the PID control setup:
a) Continuous dispensing: Several runs of continuous dispensing demonstrated the automatic pressure adjustment to consistently meet a specified target flow rate independently of the user. Compared to the constant pressure setting, the adaptive pressure control proved effective in compensating for environmental or system-related influences like nozzle clogging. b) Adaptation to ink inhomogeneities: A more realistic use case was investigated by printing hollow cylinders from a cartridge filled with layers of two differently concentrated poloxamer~407 inks to simulate ink inhomogeneities. The adaptive pressure control was able to generate a constant flow rate by adapting the pressure appropriately during the printing process. As a result, relatively consistent cylinders could be printed, whereas the constant pressure setting resulted in cylinders with strongly deviating wall thicknesses. c) Process transfer to other nozzle types: To demonstrate the simple process transferability between different experimental setups, test prints were carried out with three different nozzle types with the same orifice diameter. The adaptive pressure control was able to generate the same constant flow rate with all three nozzle types within an adjustment phase of 30 to 60 s. The resulting cylinders were of consistent quality, independent of the nozzle. Prints with constant pressure setting suffered from a lack or abundance of extruded ink, if not performed with a pressure specifically determined for the corresponding nozzle type. The performance of the PID-regulated adaptive pressure control demonstrated that it can contribute to making extrusion-based bioprinting more reliable and reduce the need for extensive parameter screenings in process development.
Overall, the present work provides a toolbox for the printing of biocatalytically active materials. Novel inks with individually adapted printing methods and analytical techniques are presented. The application of emulsion-based inks demonstrates the wide range of materials that can be applied in combination with enzymes despite not being suitable matrices in tissue engineering. Material screenings can be accelerated by employing microplate-based activity assays and the adaptation of the printing setup specifically for each type of ink shows the need for fine-tuning between ink and printing method. The more universal approach to improve reproducibility in bioprinting using a PID-based pressure control could be valuable for applications outside the scope of biocatalysis.