Abstract:
Nematodenfressende Pilze (NFP) sind eine große Gruppe von räuberischen Mikroorganismen, von denen einige dreidimensionale Fangnetze bilden, um Nematoden zu fangen. Bei Nährstoffmangel in ihrem Lebensraum und in Gegenwart von Nematoden gehen sie vom Saprotrophismus zu einer räuberischen Lebensweise über. Die Produktion von Fangzellen und die Sekretion von niedermolekularen Verbindungen sind Indikatoren für die Änderung der Lebensweise. Ich habe den NTF Arthrobotry flagrans (früher Duddingtonia flagrans) untersucht und Caenorhabditis elegans als Beute verwendet. Die räuberischen Pilze geben attraktive Geruchsstoffe ab, um ihre Beute anzulocken, und das Polyketid Arthrosporole, um die Falleninduktion zu hemmen. ... mehrAndererseits sondert Caenorhabditis elegans Ascaroside als Pheromone ab, die viele Entwicklungsprozesse in C. elegans steuern. Sie werden auch von A. flagrans erkannt und induzieren die Fallenbildung durch Herunterregulieren des Arthrosporol-Biosynthesewegs. Es stellt sich die Frage, wie der Räuber die von den Nematoden stammenden Askaroside wahrnimmt und wie die externen Signale übertragen werden, um die Arthrosporol-Biosynthese des Pilzes herunterzuregulieren.
Ich nahm an, dass diese Aufgabe von G-Protein-abhängigen Signalen erfüllt wird. Heterotrimere G-Proteine sind in allen Eukaryonten konserviert und sind entscheidende Elemente für die Wahrnehmung und Übertragung extrazellulärer Signale in die Zellen, um die richtigen biochemischen und physiologischen Reaktionen auszulösen. G-Protein-Signalwege umfassen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren GPCRs (G-protein-coupled receptors) und α-, β- und γ-Untereinheiten eines G-Proteins sowie eine Vielzahl von Regulatoren. Wenn ein GPCR externe Signale bindet, aktiviert er die G-α-Untereinheit, um GDP gegen GTP auszutauschen, was die Dissoziation von Gα-GTP aus dem βγ-Dimer beschleunigt und nachgeschaltete zelluläre Reaktionen auslöst.
Ich analysierte die Hauptkomponenten der G-Protein-Kaskaden, die G-alpha-Untereinheiten (G-alpha subunits, Gas). In A. flagrans wurden drei kodierende Gene für Gas-Proteine identifiziert, nämlich gasA, gasB und gasC, und sie wurden einzeln durch homologe Rekombination deletiert. Im Gegensatz zum Wildtyp zeigte der GasA-Deletionsstamm in Anwesenheit von C. elegans oder angereicherten Ascarosiden keine Herabregulierung des artA-Clusters, was darauf hindeutet, dass GasA eine Rolle bei der Erkennung von Ascarosiden spielt, die von Nematoden stammen. Daher produzierte der Stamm keine Fallen. Ein Stamm mit GasB-Deletion produzierte weniger Konidien und Lufthyphen und deutlich weniger Fallen, jedoch mehr als die GasA-Mutante. In den Substrathyphen waren die Transkriptionshäufigkeiten des artA-Genclusters in dem gasB-mutanten Stamm höher als im Wildtyp. In einem gasC-Deletionsstamm wurde kein Defekt beobachtet. Kurz gesagt, GasA fungiert als Schalter für die Falleninduktion, während GasB die Fallenanzahl moduliert. Die im GasB-Deletionsstamm beobachteten Phänotypen wurden durch Zugabe von 8'-Bromo-cAMP (einem Analogon von cAMP) gerettet, was darauf hindeutet, dass GasB cAMP als zweiten Botenstoff verwendet. Außerdem wirkt der Transkriptionsfaktor Ste12 stromaufwärts des artA-Clusters, indem er dessen Expressionsniveau reguliert.
Ich habe auch die Rolle von G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen (GPCRs) untersucht. In A. flagrans wurden GPCRs aus konservierten Gruppen identifiziert, und einer der Rezeptoren der Kohlenstoffklasse, GprC, war für die Herstellung von Fallen wesentlich. Interessanterweise konnte die normale Morphogenese der Fallen in einem gprC-Deletionsstamm wiederhergestellt werden, indem ein chimäres Protein eingeführt wurde, das aus der N-terminalen Hälfte der C. elegans-Rezeptoren SRBC-64, SRBC-66 oder Daf-38 und der von A. flagrans stammenden C-terminalen Hälfte von GprC besteht. Dies könnte der erste Beweis für einen horizontalen Gentransfer (horizontal gene transfer, HGT) sein.
Zusätzlich zur Analyse der G-Protein-Signalwege in A. flagrans wurde ein mutmaßliches Effektorprotein (putative effector protein, PefD) in diesem Pilz charakterisiert. Das Gen pefD beherbergt ein Signalpeptid und ein Propeptid. Das Signalpeptid erwies sich als funktionell, was darauf hindeutet, dass PefD sezerniert wird. Das Vorhandensein eines Propeptids deutet auf eine weitere Verarbeitung hin, um das reife Protein zu erhalten. Das pefD-Gen wurde in Fallen induziert, wie sowohl durch quantitative RT-PCR als auch durch einen Reporter-Assay nachgewiesen wurde. Eine mit fluoreszierenden Proteinen markierte Lokalisierungsanalyse ergab, dass sich PefD während des Nematodenfangs an der Penetrationsstelle anreichert. Ein A. flagrans-Stamm, der PefD überexprimiert, zeigte eine hohe nematizide Aktivität, was darauf hindeutet, dass PefD an der Bekämpfung von Nematoden beteiligt ist. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der Kommunikation zwischen einem Pilz und einem Nematoden bei und wirft ein Licht auf die molekularen Komponenten, die an der Signalübertragung und am Abtötungsprozess beteiligt sind.
Abstract (englisch):
Nematode-trapping fungi (NTF) are a large group of predatory microorganisms some of which form three-dimensional trapping networks to capture nematodes. When the living environment is deprived of nutrients and in the presence of nematodes, they switch from saprotrophism to a predatory lifestyle. The production of trap cells and the secretion of low molecular compounds are indicators of lifestyle change. I studied the NTF Arthrobotry flagrans (formerly Duddingtonia flagrans) and used Caenorhabditis elegans as prey. The predacious fungi emit attractive olfactory substances to lure their prey and the polyketide arthrosporols to inhibit trap induction. ... mehrOn the other hand, Caenorhabditis elegans secretes ascarosides as pheromones which control many developmental processes in C. elegans. They are also recognized by A. flagrans and induce trap formation by downregulation of the arthrosporol biosynthesis pathway. The question arises of how the predator senses ascarosides derived from nematodes and how the external signals are transmitted to downregulate the fungal arthrosporol biosynthesis.
I assumed that G-protein dependent signaling fulfills this task. Heterotrimeric G-proteins are conserved among all eukaryotes and are critical elements for sensing and transmitting extracellular signals into the cells to induce proper biochemical and physiological responses. G-protein signaling pathways comprise G-protein-coupled receptors (GPCRs) and α, β and γ subunits of a G-protein, and a variety of regulators. When a GPCR binds external cues, it activates the G-α subunit to exchange GDP for GTP which accelerates the dissociation of Gα-GTP from the βγ dimer, inducing downstream cellular responses.
I analyzed the main components of G-protein cascades, G-alpha subunits (Gas). Three encoding genes of Gas proteins were identified in A. flagrans, namely gasA, gasB and gasC, and they were deleted individually by homologous recombination. In contrast to wild type the gasA-deletion strain did not show the down-regulation of the artA cluster in the presence of C. elegans or enriched ascarosides, indicating that GasA plays a role in sensing nematode-derived ascarosides. Hence, the strain did not produce traps. A gasB-deletion strain produced fewer conidia and aerial hyphae and significantly fewer traps, but more than the gasA-mutant. In substrate hyphae, the transcript abundances of the artA gene cluster were higher in the gasB-mutant strain compared to wild type. No defect was observed in a gasC-deletion strain. In short, GasA acts as the switch of trap induction while GasB modulates the trap number. The phenotypes observed in the gasB-deletion strain were rescued by adding 8’-Bromo-cAMP (an analog of cAMP), indicating that GasB uses cAMP as second messenger. Additionally, the transcriptional factor Ste12 acts upstream of the artA cluster by regulating its expression level.
I also studied the role of G-protein coupled receptor proteins (GPCRs). GPCRs of conserved groups were identified in A. flagrans, and one of the receptors of the carbon class, GprC, was essential for the production of traps. Interestingly, normal trap morphogenesis in a gprC-deletion strain was restored by introducing a chimeric protein that is composed of the N-terminal half of the C. elegans SRBC-64, SRBC-66 or Daf-38 receptors and the A. flagrans-derived C-terminal half of GprC. This could be first evidence for horizontal gene transfer (HGT).
In addition to the G-protein signaling pathway analysis in A. flagrans, a putative effector protein (PefD) was characterized in this fungus. The gene pefD harbors a signal peptide and a propeptide. The signal peptide was demonstrated to be functional, suggesting that PefD is secreted. The presence of a propeptide suggests further processing to obtain the mature protein. The pefD gene was induced in traps as demonstrated by both, quantitative RT-PCR and a reporter assay. Localization analysis tagged with fluorescent proteins revealed that PefD accumulates at the penetration site during nematode capturing. A pefD over-expressing A. flagrans strain displayed highly nematicidal activity, indicating its involvement in the attack against nematodes.
Taken together, this work contributes to a better understanding of interkingdom communication between a fungus and a nematode and sheds light on the molecular components involved in signaling and in the killing process.
