Abstract:
Angesichts der zunehmenden Verknappung fossiler Ressourcen und der Herausforderungen im Zusammenhang mit Treibhausgasemissionen gewinnt die Umstellung unserer hauptsächlich auf Erdöl, Kohle und Erdgas basierenden Wirtschaft auf eine Bioökonomie zunehmend an Bedeutung. Im Zuge dessen müssen herkömmliche Syntheseverfahren durch biobasierte Prozesse ersetzt werden. Die Forschung zur Herstellung verschiedenster Produkte aus erneuerbaren Rohstoffen hat sich bisher hauptsächlich auf Saccharide wie Glukose als Kohlenstoffquelle konzentriert und steht damit in Konkurrenz zur Lebens- und Futtermittelproduktion. ... mehrDie Nutzung der Kohlenstoffquelle Acetat stellt dazu eine vielversprechende Alternative dar. Aus Biomasse gewonnene Substrate enthalten häufig Essigsäure, die durch Abspaltung von Acetylgruppen aus der Hemicellulose entsteht. Dazu gehören beispielsweise Lignocellulosehydrolysate und Pyrolyseprodukte, in denen Acetat ein Haupt¬bestandteil sein kann. Außerdem kann Essigsäure durch Synthesegasfermentation mittels acetogenen Bakterien gewonnen werden. Daher sind acetathaltige, aus Biomasse gewonnene Substrate eine vielversprechende Kohlenstoffquelle im Kontext der Bioökonomie. Äpfelsäure gehört zu den Chemikalien, die derzeit aus fossilen Rohstoffen synthetisiert werden. Die Dicarbonsäure wird hauptsächlich als Säuerungsmittel und Geschmacksverstärker in der Lebensmittelindustrie verwendet, kann aber auch als Bestandteil von Kosmetikartikeln, Reinigungsprodukten, Arzneimitteln oder zur Synthese von Polymeren genutzt werden. Als Zwischenprodukt des Tricarbon¬säurezyklus hat Äpfelsäure ein großes Potenzial, mikrobiell hergestellt zu werden. Trotz der Verfügbarkeit verschiedener Produktionsorganismen ist die fermentative Äpfelsäuresynthese im Vergleich zur chemischen Herstellung jedoch noch nicht wirtschaftlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die mikrobielle L-Äpfelsäureproduktion aus Acetat als Möglichkeit einer biobasierten Synthese der organischen Säure untersucht. Aspergillus oryzae DSM 1863 wurde dafür als Produktionsstamm gewählt, da dieser filamentöse Pilz ein potenter natürlicher Malatproduzent und ein robuster Mikroorganismus gegenüber Inhibitoren ist, die in aus Biomasse gewonnenen Substraten enthalten sein können.
Zunächst wurden Experimente im Schüttelkolbenmaßstab durchgeführt, um verschiedene grund-legende Aspekte der Äpfelsäureproduktion aus Acetat zu untersuchen. Dazu gehörten die Bestimmung der optimalen Substratkonzentration im Batch-Verfahren, sowie der Einfluss der Kultivierungstemperatur und der Art der Stickstoffquelle. Es wurde festgestellt, dass die initiale Acetat¬konzentration die Morphologie und das Spektrum der von A. oryzae produzierten organischen Säuren beeinflusst. In Medien mit Substratkonzentrationen bis zu 30 g/L wurden Biomasse¬pellets gebildet, wohingegen eine filamentöse Morphologie ab 40 g/L Essigsäure beobachtet wurde. Für die Malatproduktion im Batch-Prozess erwies sich eine Substratkonzentration von 45 g/L Essig¬säure als am besten geeignet, womit eine maximale Äpfelsäurekonzentration von 8,44 ± 0,42 g/L, eine Produktionsrate von 0,044 ± 0,002 g/L/h, sowie eine Ausbeute von 0,19 ± 0,01 g/g erreicht wurden. Bei einer höheren Konzentration von 55 g/L Essigsäure war die maximale Produktionsrate verringert, was auf eine Substrathemmung hindeutet. Die Analyse der Nebenprodukte zeigte einen Einfluss der initialen Substratkonzentration auf das Säurespektrum. Niedrige Acetatkonzentrationen führten beispielsweise zu einem höheren Anteil an Oxalsäure. Im Vergleich zur Kultivierung mit Glukose erhöhte sich bei der Verwendung von 45 g/L Essigsäure der Anteil des Nebenprodukts Succinat, das etwa 35-40% der Gesamtsäurekonzentration ausmachte, während der Anteil der Äpfel¬säure etwa 55% betrug. Es wurde außerdem festgestellt, dass auch die Kultivierungstemperatur während der Malatproduktion das Spektrum der Nebenprodukte beeinflusst. Obwohl sich die Produktbildung mit steigender Temperatur beschleunigte, nahm dabei der Anteil von Malat zugunsten von Succinat ab, weshalb eine Kultivierungstemperatur von 32 °C als optimal bewertet wurde. Die Untersuchung des Einflusses verschiedener Stickstoffquellen auf das Wachstum von A. oryzae zeigte einen früheren Beginn der Konidienkeimung und einen um bis zu 3,9-fach höheren Biomassetiter bei Verwendung von komplexen Stickstoffquellen im Vergleich zu Kulturen mit Ammoniumsulfat. Während der Säureproduktionsphase beschleunigte insbesondere die Verwendung von Hefe¬extrakt die Malatsynthese. Weiterhin wurde die Äpfelsäureproduktion auch durch Supplementierung des Acetatmediums mit niedrigen Glukosekonzentrationen im Bereich von 5 15 g/L beschleunigt. Dabei wurde festgestellt, dass A. oryzae beide Kohlenstoffquellen gleichzeitig verstoff¬wechselte, was eine interessante Beobachtung für die künftige Nutzung von biomassebasierten Substraten ist.
Während mit einer Acetatkonzentration von 45 g/L die höchsten Äpfelsäure- und Biomassetiter erzielt wurden, führte die Verwendung dieser Substratkonzentration zu einer hauptsächlich filamentösen Morphologie. Diese Beobachtung ist wahrscheinlich auf eine hohe Ionenkonzentration in acetatreichen Medien zurückzuführen. Eine pelletartige Morphologie wird jedoch häufig bevorzugt, da diese zu einer geringeren Viskosität des Fermentationsmediums führt, wodurch ein besserer Wärme-, Sauerstoff- und Nährstofftransport gewährleistet werden kann. Daher wurde die Möglichkeit der Immobilisierung von A. oryzae durch Einschluss in natürliche Polymere als Werkzeug zur morphologischen Kontrolle während der Äpfelsäureproduktion mit A. oryzae untersucht. Da dies in der Literatur zuvor nicht beschrieben war, wurden Versuche zum Vergleich sowohl in Medien mit Acetat als auch mit Glukose durchgeführt. Dazu wurden Konidien in verschiedenen Konzentrationen von Alginat, Agar und κ-Carrageen eingeschlossen. Eine Malatbildung wurde unter allen Bedingungen nachgewiesen, es ließen sich jedoch Unterschiede zwischen den beiden Kohlenstoffquellen hinsichtlich der Produktionsrate, des maximalen Produkttiters und der Matrixstabilität feststellen. In glukosehaltigem Medium waren alle Polymere stabil, und mit immobilisiertem A. oryzae wurden ähnliche Produktkonzentrationen erzielt wie mit natürlich gebildeten Biomassepellets. Bei Verwendung eines acetathaltigen Mediums hingegen war die Produktion in Schüttelkolbenkulturen geringer als mit freiem Myzel und die Inkubation der Polymerstrukturen in diesem Medium hatte nach längerer Zeit eine negative Wirkung auf deren Stabilität. In späteren Stadien der Fermentation tendierten die Alginatstrukturen dazu, sich aufzulösen und es wurde eine Ablösung der Biomasse von den Agar- und κ-Carrageen-Strukturen beobachtet. Trotz dieser Herausforderungen erwies sich der Polymereinschluss von A. oryzae in 2,5 L-Bioreaktorkulturen mit acetathaltigem Medium als vorteilhaft, da eine Ablagerung der Biomasse an Reaktoreinbauten verhindert wurde, was zu einer verbesserten Produktion führte.
Aufgrund der festgestellten Substrathemmung mit Acetat als Kohlenstoffquelle im Batch Prozess ist die maximale Malatkonzentration auf Werte von weniger als 10 g/L begrenzt. Um diese Hemmung durch eine initial hohe Substratkonzentration zu umgehen, ist ein Fed-Batch- oder Repeated-Batch-Verfahren geeignet. Diese Möglichkeiten wurden zunächst in Schüttelkolben-kulturen mit Ammoniumsulfat oder Hefeextrakt als Stickstoffquelle untersucht. Im Repeated-Batch-Verfahren konnte die Produktionsrate über eine Kultivierungszeit von 240 Stunden, was drei Medienwechseln entsprach, erfolgreich auf einem hohen Niveau gehalten werden. Dabei wurde die höchste absolute Malatmenge verglichen mit den zwei anderen Prozessstrategien quantifiziert. Eine Prozessoptimierung ist jedoch erforderlich, um die Produktivität auch über eine höhere Anzahl von Zyklen aufrechtzuerhalten. Auch das Fed-Batch Verfahren zeigte Vorteile gegenüber dem Batch-Verfahren, da der Produktionszeitraum verlängert und höhere maximale Produkt¬konzentrationen (11,49 ± 1,84 g/L mit (NH4)2SO4 und 12,08 ± 1,25 g/L mit Hefeextrakt) erzielt wurden. Die Produktionsraten sanken jedoch im Verlauf der Kultivierung, was höchstwahrscheinlich auf ein wiederholtes Absinken des pH-Werts auf Werte zwischen 5,5 und 6,0 infolge der manuellen Zugabe von Essigsäure zurückzuführen ist. Daher wurde die Möglichkeit der Verwendung einer pH-gekoppelten Zufuhr von Essigsäure in 2,5-L-Bioreaktor-Fermentationen untersucht. Ein Vorteil von acetatbasierten Prozessen ist, dass der aufgrund des Substratverbrauchs verursachte Anstieg des pH-Werts durch die Verwendung von Essigsäure zur pH-Kontrolle bei gleichzeitiger Zugabe von zusätzlichem Kohlenstoff ausgeglichen werden kann. Mit einer pH gekoppelten Zufuhr von 10 M Essigsäure wurde nach 264 h ein maximaler Äpfelsäuretiter von 29,53 ± 1,82 g/L erreicht, was einer 5,3-fachen Steigerung gegenüber dem Batch-Prozess ohne pH Kontrolle entspricht. Außerdem wurde die Ausbeute auf 0,29 ± 0,01 g/g erhöht und die bisher höchste Gesamtproduktionsrate von 0,112 ± 0,007 g/L/h erreicht. Da die Malatproduktion gegen Ende der Fermentation trotz Kohlenstoffverfügbarkeit stoppte, wurde außerdem eine mögliche Produkt-hemmung untersucht. Versuche mit Zugabe von bis zu 50 g/L Äpfel- und Bernsteinsäure zeigten, dass A. oryzae trotz Produktkonzentrationen in diesem Bereich in der Lage ist, weiter organische Säuren zu produzieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit einen breiten Überblick über verschiedene Aspekte der L-Äpfelsäureproduktion aus Acetat mit dem Wildtyp A. oryzae DSM 1863 bietet. Während der Nutzung von Acetat als Kohlenstoffquelle wurden einige Herausforderungen identifiziert wie beispielsweise eine vom pH-Wert beeinflusste Substrathemmung, ein Einfluss von acetathaltigen Medien auf die Morphologie, und ein höherer Anteil an Nebenprodukten verglichen mit glucosebasierten Kultivierungen. Daher wurden Strategien untersucht und entwickelt, um eine effiziente Malatproduktion trotz dieser Anforderungen zu ermöglichen, und Optionen für eine weitere Optimierung aufgezeigt. Insbesondere die Entwicklung geeigneter Prozessführungsstrategien wie die Nutzung von Essigsäure zur pH-Kontrolle und als gleichzeitige Substratzufuhr sind für eine Steigerung der Malatproduktion mit Acetat als Kohlenstoffquelle von Bedeutung.
Abstract (englisch):
Given the increasing scarcity of non-renewable resources and the challenges associated with greenhouse gas emissions, a shift from our mainly fossil-based economy to a bioeconomy becomes increasingly important. Therefore, manufacturing methods using fossil raw materials need to be replaced by bio-based processes. Research on product synthesis from renewable feedstock has been mainly focused on saccharides such as glucose as carbon source, thus competing with food and feed production. The utilization of acetate could represent a promising alternative since many substrates derived from biomass contain acetic acid due to the cleavage of acetyl groups from hemicellulose during pretreatment. ... mehrThese include lignocellulosic hydrolysates and products of fast pyrolysis in which acetate can be a main constituent. Furthermore, acetic acid can be obtained through the fermentation of syngas by acetogens. Thus, acetate-containing substrates derived from biomass represent an important feedstock in a bioeconomy. Malic acid belongs to the chemicals which are currently synthesized from petroleum or natural gas. The dicarboxylic acid is mainly used as acidulant and taste enhancer in the food industry but can furthermore serve as a component in personal care and cleaning products, pharmaceuticals, or polymers. As an intermediate of the tricarboxylic acid cycle, malic acid has great potential to be produced microbially. However, despite the availability of various production organisms, fermentation processes for malic acid production are not yet economically competitive compared to chemical manufacturing. This work therefore evaluated microbial L-malic acid production from acetate as an option for bio-based synthesis of the organic acid. Being a potent natural malate producer and robust microorganism towards inhibitors contained in biomass-derived substrates, Aspergillus oryzae DSM 1863 was selected as production strain.
First experiments were performed in shake flasks to evaluate several aspects of malic acid production from acetate such as the optimal substrate concentration and temperature, or the effect of the type of nitrogen source. The initial acetate concentration was found to influence the morphology and the organic acid spectrum produced by A. oryzae. In media with substrate concentrations up to 30 g/L, biomass pellets were formed, whereas a filamentous morphology was obtained at 40 g/L acetic acid and above. Regarding malic acid production, 45 g/L of the carbon source was identified as most suitable, resulting in a maximum product titer of 8.44 ± 0.42 g/L with a production rate of 0.044 ± 0.002 g/L/h and a yield of 0.19 ± 0.01 g/g. At a higher substrate concentration of 55 g/L the maximum production rate was reduced, suggesting substrate inhibition. Analysis of the side products showed a correlation between the concentration of the carbon source and the acid spectrum. Low initial acetate concentrations were not suitable for malate synthesis due to an increased production of oxalic acid. Compared to cultivations with glucose, the utilization of 45 g/L acetic acid increased the concentration of the side product succinate, resulting in about 35-40% of the total acid concentration while malic acid amounted to about 55%. The cultivation temperature during malate production was also found to affect the side product spectrum. Although product formation accelerated with increasing temperature, the share of malic acid decreased in favor of succinic acid. Therefore, of the four cultivation temperatures tested in the range of 29-38 °C, a temperature of 32 °C was found to be optimal. Evaluation of different nitrogen sources showed an accelerated onset of germination and enhanced biomass titer with the complex compounds which was increased up to about 3.9-fold compared to cultures with ammonium sulfate. During the acid production phase, especially the utilization of yeast extract accelerated malate synthesis. Product synthesis was also accelerated by the supplementation of acetate medium with low concentrations of glucose in the range of 5-15 g/L. It was found that both carbon sources were metabolized concurrently which is an interesting observation for the future utilization of biomass-derived substrate for malic acid production.
Whereas acetate concentrations of around 45 g/L resulted in the highest malic acid titer and productivity, a filamentous-lumpy morphology was observed most likely due to a high ion concentration. As a pelleted morphology ensures a lower viscosity of the fermentation broth, leading to a better heat, oxygen, and nutrient transfer, it is often preferred. Therefore, the possibility of whole-cell immobilization by entrapment in natural polymers was evaluated as a tool for morphological control during L-malic acid production with A. oryzae. Since this has not been reported in the literature before, experiments were performed both in media with acetate and glucose for comparison. A. oryzae was entrapped in different concentrations of alginate, agar and κ carra¬geenan and malic acid was detected with all conditions. However, differences were observed between the two carbon sources in terms of production rate, maximum product titer and matrix stability. In glucose medium, all immobilization matrices were stable and similar product concentrations were obtained with immobilized particles compared to cultivations with naturally formed biomass pellets. On the other hand, when medium containing acetate was used, production with entrapped A. oryzae was lower than with free mycelium in shake flask cultures. Furthermore, incubation in acetate medium had a negative effect on the stability of the entrapped particles as disintegration of alginate beads and biomass detachment from the agar and κ-carrageenan matrices was observed in later stages of the fermentation. Despite these challenges, entrapment of A. oryzae proved advantageous in 2.5-L bioreactor cultivations with acetate by preventing the biomass from attaching to the bioreactor installations, resulting in increased malic acid titers.
Due to substrate inhibition observed in a batch process, the maximum malate concentration from acetate is limited to less than 10 g/L. Therefore, a fed-batch or repeated-batch process is more suitable. These possibilities were first evaluated in shake flask cultivations with ammonium sulfate or yeast extract as nitrogen source. In the repeated-batch process, the production rate was successfully maintained at a high level for a cultivation time of 240 h during which three medium exchanges were performed. Furthermore, the highest absolute malate amount was quantified. However, process optimization is required to maintain the productivity for an increased number of cycles. Compared to the batch process, the period of malic acid production was extended, and a higher maximum titer was obtained in the fed-batch process (11.49 ± 1.84 g/L with (NH4)2SO4 and 12.08 ± 1.25 g/L with yeast extract). The production rate in this process declined in later stages of cultivation, most likely due to a repeated drop of the pH to values between 5.5-6.0 as a consequence of the manual addition of acetic acid. Therefore, the possibility of using a pH-coupled feed of acetic acid in 2.5-L bioreactor fermentations was assessed. An advantage of processes based on acetate is that the increase of pH caused by the consumption of the substrate can be counteracted by using acetic acid for pH control, simultaneously supplying additional carbon. With a pH-coupled feed of 10 M acetic acid, a maximum malic acid titer of 29.53 ± 1.82 g/L was obtained after 264 h, which is a 5.3-fold increase compared to the batch process without pH control. Furthermore, the yield was increased to 0.29 ± 0.01 g/g and the highest reported overall production rate of 0.112 ± 0.007 g/L/h was obtained. Since malate production ceased in later process stages despite carbon availability, a possible product inhibition was evaluated. Experiments with up to 50 g/L malic and succinic acid added to the medium showed that A. oryzae is capable of organic acid production despite the presence of high product concentrations.
In conclusion, this work provides a comprehensive overview of various aspects of L-malic acid production from acetate with wild-type A. oryzae DSM 1863. While using acetate as a carbon source, several challenges were identified such as a pH-dependent substrate inhibition, an effect of acetate-containing media on the morphology, and a higher share of side products compared to glucose-based cultivations. Therefore, strategies were investigated and developed to enable efficient malate production despite these challenges, and options for further optimization were highlighted. Especially the development of suitable process management strategies such as the use of acetic acid for pH control and substrate supply is of particular importance to enhance malate production from acetate.
