Retinal Pigment Epithelium Derived from Mouse Embryonic Stem Cells Enhances Photoreceptor Differentiation in Retinal Organoids

Die Netzhaut der Wirbeltiere ist ein mehrschichtiges neuronales Gewebe, das sich aus der Neuroretina und dem retinalen Pigmentepithel (RPE) zusammensetzt. Die Neuroretina beinhaltet einen Glia- und sechs neuronale Zelltypen, die Informationen mittels lichtsensitiver Fotorezeptorzellen aufnehmen, verarbeiten und weiterleiten. Die Fotorezeptoren sind im RPE eingebettet, das wichtige Funktionen in der Entwicklung und Instandhaltung der Retina übernimmt. Melanosomen im RPE sind Kompartimente, deren Hauptaufgabe darin besteht Licht zu absorbieren Da das RPE die Blut-Retina-Schanke aufbaut, vermittelt es den Austausch von Molekülen zwischen Retina und Aderhaut. ... mehrAußerdem phagozytieren RPE-Zellen die äußeren Segmente der Fotorezeptoren und regenerieren deren Sehpigment in mehreren enzymatischen Schritten.
In der dreidimensionalen Zellkultur gibt es Methoden zur Herstellung von organähnlichen Strukturen, die Organoide genannt werden. Mithilfe etablierter Protokolle können Strukturen ähnlich der Netzhaut entwickelt werden, die sich selbstorganisierend in retinale Organoide (ROs) ausdifferenzieren. In diesen Organoiden sind RPE-Zellen jedoch zu meist nicht vorhanden oder nicht in der räumlichen Nähe und Anordnung zu den neuroretinalen Arealen.
In dieser Arbeit wurden RPE-Zellen separat aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESZ) differenziert. Die mESZ-RPE-Zellen exprimierten RPE spezifische Markergene, deren Expression mittels digital droplet PCR gemessen wurde. In Immunfärbungen konnte sowohl die morphologische als auch strukturelle Maturation der Zellen gezeigt werden. Die mESZ-RPE-Zellen wurden auf permeablen Membranen kultiviert, die den Austausch von Nährstoffen erlauben, was den Aufbau der Blut-Retina-Schranke nachstellt. Da ROs kein vollständig maturiertes retinales Gewebe aufweisen, wurde ein in vitro Co-Kultivierungssystem mit RPE-Zellen und ROs etabliert, welches es erlaubt die gemeinsame Entwicklung der beiden Gewebe zu verfolgen und zu untersuchen.
ROs können für einen Zeitraum von drei bis sechs Tagen mit RPE-Zellen kultiviert werden. Per Immunohistochemie konnte in Gefrierschnitten von ROs eine Erhöhung der Anzahl an Otx2 und Crx exprimierenden Fotorezeptoren ermittelt werden. Lösliche Faktoren, die von den RPE-Zellen abgegeben werden, haben auf ROs einen ähnlichen Effekt. Expressionsmuster der Proliferations- und Mitosemarker Ki67 und phosphoryliertes Histon H3 ser10 belegen, dass Neurogenese in ROs nach dem Mechanismus der interkinetischen Zellkernmigration erfolgt. Die Co-Kultivierung von mESZ-RPE hat einen starken Einfluss auf die Differenzierung von Fotorezeptoren in ROs und gibt Einblicke in die Interaktion von Neuroretina und RPE, um Mechanismen der in vivo Retinogenese besser verstehen zu können.

The vertebrate retina is a multi-layered neuronal tissue composed of the neural retina and the retinal pigment epithelium (RPE). The neural retina consists of one glial cell type and six neuronal cell types that modulate and transmit information perceived by the light-sensitive photoreceptor cells. Photoreceptors are embedded in the RPE, which has crucial functions during development and maintenance of retinal integrity. Melanosomes in the RPE contain high amounts of Melanin which absorbs scattered light to increase visual quality. In the mature retina, the RPE establishes the outer blood-retina barrier and thus has to set up a bidirectional transport between the retina and the choroid. ... mehrSince photoreceptors cannot regenerate their visual pigment, many enzymatic reactions to maintain the visual cycle occur in RPE cells. Furthermore, shed photoreceptor outer segments are phagocytosed and recycled in the RPE.
Three-dimensional cell culture offers methods for the generation of organ-like structures, termed organoids. By the use of established protocols, mouse embryonic stem cells (mESCs) can develop retina-like structures by self-organization and differentiation. In retinal organoids (ROs) however, RPE cells are either completely absent or only sparsely present and not adjacent to the neural retinal tissue.
In this work, RPE cells were differentiated using a separate protocol. mESC-derived RPE cells expressed RPE-specific genes which were measured via digital droplet PCR. Immunocytochemical results demonstrated morphological as well as structural maturation. mESC-derived RPE cells were grown on permeable membranes which allowed nutrient exchange mimicking the outer blood-retina barrier. Since neuronal cell types do not fully mature in ROs, an in vitro co-cultivation system with mESC-derived RPE cells and ROs was established that allowed the investigation of the co-development of both tissues.
In this setup, maturating ROs were cultivated with mESC-derived RPE cells for periods of three to six days. Immunostaining of cryosectioned ROs identified more Otx2 and Crx expressing photoreceptor cells after co-cultivation. mESC-derived RPE conditioned medium had similar effects on ROs suggesting that soluble factors from RPE cells might also modulate neuronal differentiation. Expression pattern of the proliferation- and mitosis- markers Ki67 and phosphorylated Histone H3ser10 revealed that neurogenesis in ROs follows the in vivo mechanism, termed interkinetic nuclear migration. In summary, co-cultivation of mESC-derived RPE strongly enhances the differentiation of photoreceptors in ROs and gives insights in the interplay between neural retina and RPE during development to understand mechanisms of in vivo retinogenesis.