Substrate specificities of baking lipases for use in fine bakery goods

Lipasen werden seit Jahrzehnten als clean-label Alternativen für herkömmliche Emulgatoren zur Verbesserung der Backeigenschaften von Brot eingesetzt. Für Feine Backwaren gibt es jedoch bisher nur wenige Anwendungen.
Bei der Reaktion von Lipasen mit Butter, einem üblicherweise in Feinen Backwaren eingesetzten Fett, werden geruchsintensive kurzkettige Fettsäuren freigesetzt. Um deren Freisetzung und damit die Bildung von ranzigen Fehlaromen zu begrenzen, werden Lipasen mit geeigneten Fettsäuresubstratspezifitäten benötigt. Dazu wurden 17 Lipasen mithilfe des p-Nitrophenyl-Assays auf die Fettsäuren hin untersucht, die sie bevorzugt freisetzen. ... mehrDas aus dem Assay resultierende, breite Spektrum an Fettsäuresubstratspezifitäten konnte bei der Reaktion mit Backfetten in neu entwickelten Modellemulsionen jedoch nicht bestätigt werden. Stattdessen war die Struktur der Grenzfläche entscheidend für die Freisetzung von Fettsäuren. Sieben Lipasen wurden aufgrund ihrer Reaktionsmuster im p-Nitrophenyl-Assay und ergänzenden, sensorischen Experimenten mit den Modellemulsionen für weitere Versuche ausgewählt.
Die Einsatzmöglichkeiten von Lipasen in Feinen Backwaren mit unterschiedlichen Rezepturen wurden am Beispiel eines eifreien Rührkuchens, eines traditionellen Sandkuchens und einer hefebasierten Brioche untersucht. Die Lipasen beeinflussten die Eigenschaften von Kuchenteigen und Backwaren. Das Ausmaß der Veränderung hing dabei sowohl von der Rezeptur, als auch von der Lipase ab. Enthielt die Rezeptur intrinsische, oberflächenaktive Moleküle wie polare Ei-Lipide in Sandkuchen, waren die Effekte der Lipasen schwächer als in der Rezeptur ohne Ei. In Brioche wurden nur geringe bis keine Verbesserungen der Backqualität erreicht. Die Unterschiede der Lipasen wurden auf ihre Reaktionsmuster zurückgeführt.
Diese Hypothese unterschiedlicher Reaktionsmuster wurde durch Lipidomics-Analysen von Lipase-behandelten Teig- und Kuchenproben weiter untersucht. Dazu wurde eine Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie Methode genutzt. Durch den Vergleich der Substratspezifitätsmuster der Lipasen mit den Ergebnissen zu ihren Auswirkungen auf die Backqualität wurden mögliche Schlüsselverbindungen für die Backqualität ermittelt. Bei Rührkuchen ist die Hydrolyse von Glyceroglycolipiden entscheidend, während in Sandkuchen Lysoglycerophospholipide mit Effekten auf die Textur in Verbindung gebracht wurden. In Brioche wurde die Reaktion der Lipasen nicht, wie ursprünglich vermutet, gehemmt, aber die Art der freigesetzten Lipide hatte keinen Einfluss auf die Backqualität.
Zur Vorhersage der Eignung einer Lipase f ür den Einsatz in Feinen Backwaren wird ein Assay benötigt. Basierend auf den Ergebnissen der Lipidomics-Analysen ist die Substratspezifität von Lipasen entscheidend für ihre Wirkung. Daher wurde ein fluorimetrischer Assay entwickelt, um die Reaktion von Lipasen mit verschiedenen Substraten zu analysieren. Die mithilfe des Assays ermittelten Reaktionsmuster stimmten jedoch nicht mit den Reaktionsmustern aus Kuchen überein. Ähnlich wie bei den Ergebnissen für die Fettsäurensubstratspezifität war die Substratspezifität ebenfalls von der Verfügbarkeit von Substraten für die Reaktion abhängig.
Diese Arbeit eröffnet neue Einblicke in die Reaktion von Lipasen und Mechanismen der (Fettsäuren)substratspezifität. Außerdem zeigte sie das Potenzial von Lipasen als Backhilfsmittel in Feinen Backwaren und ebnete den Weg für weitere zukünftige Anwendungen von Lipasen.

Lipases have been used for decades as a clean-label alternative to conventional emulsifiers to improve the baking properties of bread. However, there are only scarce applications in fine bakery goods so far.
When lipases react with butter, a fat commonly used in fine bakery goods, odour-intensive short-chain fatty acids (FA) are released. To limit their release and thus the formation of rancid off-flavours, lipases with suitable FA substrate specificities are needed. Therefore, 17 lipases were screened concerning the FA they preferentially release by the use of the p-nitrophenyl
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assay. However, the broad spectrum of FA substrate specificities resulting from the assay could not be confirmed in the reaction with baking fats in newly developed model emulsions. Instead, the structure of the interface was decisive for the release of FA. Seven lipases were selected for further experiments based on their reaction patterns in the p-nitrophenyl assay and supplementary sensory experiments with the model emulsions.
The potential uses of lipases in fine bakery goods with different recipes were investigated using an eggless basic cake, a traditional pound cake and yeast-based brioche as examples for fine bakery goods. Lipases affected the properties of cake doughs or batters and the baked products. The extent of the change depended on both the recipe and the lipase. If the recipe contained intrinsic surface-active molecules like polar lipids from egg in pound cake, the effects caused by the lipases were diminished compared to the recipe without egg. In the yeast-based brioche, little to no improvements of baking quality were achieved. Differences between the lipases were attributed to their reaction patterns.
The hypothesis of different reaction patterns was further investigated by lipidomic analyses of lipase-treated cake samples before and after baking. A liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was used for this purpose. By comparing the substrate specificity patterns of lipases with previous results for the corresponding effects on baking quality, possible key compounds for quality improvements were identified. In basic cake, the hydrolysis of glyceroglycolipids is decisive, while in pound cake, lysoglycerophospholipids were linked to textural impacts. In brioche, lipase reactions were not inhibited as originally suspected, but the type of released lipids did not affect the baking quality.
An assay to predict the suitability of a lipase for the application in fine bakery goods is needed. Based on the results from the lipidomic analysis, the substrate specificity of lipases is crucial for their impact. A fluorimetric assay was thus developed to analyse lipase reactions towards different substrates. The patterns determined in the assay did not match the ones previously
analysed in cakes. In accordance with the results for the FA substrate specificity, the substrate specificity was also dependent on the availability of substrates for the reaction.
This work provides new insights to lipase reactions and mechanisms defining FA substrate and substrate specificities. Besides, it also demonstrated the potential of lipases as baking improvers in fine bakery goods and paved the way for further future applications of lipases.