Abstract:
Der striatin-interacting protein phosphatase and kinase complex (STRIPAK-Komplex) ist ein in Eukaryoten hoch konservierter Proteinkomplex, der an der Regulation diverser zellulärer Prozesse beteiligt ist. So steuert er in Säugetieren die Organisation des Zytoskeletts, die Zellmigration und die Zellmorphologie. In pilzlichen Zellen nimmt der Komplex Einfluss auf die sexuelle Entwicklung, das Wachstum und die Zellfusion. Zu den Hauptkomponenten des STRIPAK-Komplexes zählen Kinasen, Ankerproteine, Entwicklungsproteine und die Phosphatase bestehend aus der strukturgebenden, der katalytischen und der regulatorischen Untereinheit. ... mehrDie regulatorische Untereinheit ist das Striatin-Homolog. Sie vermittelt die Interaktion des Ankerproteins und des Entwicklungsproteins und fungiert daher als inneres Gerüst des Komplexes. Das Ankerprotein sichert die Lokalisation des STRIPAK-Komplexes an den Membranen des Nukleus und der Mitochondrien. Das Entwicklungsprotein koppelt den Komplex an interne Membransysteme.
Der bereits in einigen Ascomyzeten analysierte STRIPAK-Komplex wurde im biotrophen, pflanzenpathogenen Modellorganismus Ustilago maydis das erste Mal in einem Basidiomyzeten untersucht. Ebenso wie die Deletion einer beliebigen Komponente des STRIPAK-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae resultierte die Deletion des Ankerproteins in U. maydis in der verfrühten Rückkehr aus dem pheromonabhängigen Zellzyklusarrest. Die reduzierte Anzahl von Vakuolen nach Deletion des Ankerproteins in U. maydis zeigt den Einfluss des STRIPAK-Komplexes auf die Vakuolen, der aufgrund von einer abnormalen Vakuolenmorphologie in Folge der Deletion des Ankerproteins auch in S. cerevisiae beobachtet werden konnte. Die Deletion des Ankerproteins in U. maydis führte zudem zu Defekten in der Fusion von Konjugationshyphen, was auch für die Deletion einer der Hauptkomponenten des STRIPAK-Komplexes in Sordaria macrospora beobachtet werden konnte. Auch die Länge der b-abhängigen Filamente ist nach Deletion des Ankerproteins in U. maydis reduziert, was dem Phänotyp der Deletion einer beliebigen Komponente des STRIPAK-Komplexes in Neurospora crassa ähnelt, der eine reduzierte Wachstumsrate aufweist. Zusätzlich zu den aus Ascomyzeten bekannten Auswirkungen der Deletion von STRIPAK-Komponenten führt die Deletion des Ankerproteins in U. maydis zu Zytokinese- und Polaritätsdefekten, Apathogenität verbunden mit der fehlenden Anheftung an die Pflanzenoberfläche, reduzierter Zellwand- und Plasmamembranintegrität und reduzierter Anzahl an motilen frühen Endosomen. Einzigartig ist zudem, dass sich die regulatorische Untereinheit und das Entwicklungsprotein als essenziell in U. maydis herausstellten. Aufgrund des vorliegenden Phänotyps der Deletion des Ankerproteins in U. maydis wird ein Einfluss des STRIPAK-Komplexes auf Cla4, Smu1 und UmSepA, welche Teil des Cdc42-Rac1-Signalweges sind, vermutet. Dieser reguliert in U. maydis die Hyphenfusion, Endozytose, Polarität, Zytokinese und das filamentöse Wachstum. Auch die Rolle des STRIPAK-Komplexes als Antagonist des TORC2-Komplexes, welche bereits in S. cerevisiae beschrieben wurde, wird aufgrund der reduzierten Zellwand- und Membranintegrität vermutet, da der TORC2-Komplex wesentlich für die Aktivierung des Zellwandintegritätssignalweges ist. Das Ankerprotein und das Entwicklungsprotein des STRIPAK-Komplexes wurde zudem in Sporidien von U. maydis durch Fluoreszenzmikroskopie wie in den bereits untersuchten Ascomyzeten an der Kernhülle und an Mitochondrien lokalisiert. Die regulatorische Untereinheit der Phosphatase lokalisiert zusätzlich am Endoplasmatischen Reticulum (ER), was die Lokalisation des STRIPAK-Komplexes an Mitochondrien, Kernhülle und ER in Ascomyzeten widerspiegelt. Eine Colokalisation der drei STRIPAK-Komponenten konnte ebenfalls durch Fluoreszenzmikroskopie in Sporidien gezeigt werden. Zusätzlich konnte in U. maydis durch Co-Immunopräzipitationen die Interaktion der regulatorischen Untereinheit, des Ankerproteins und des Entwicklungsproteins in Sporidien gezeigt und diese als Komponenten des STRIPAK-Komplexes bestätigt werden. Die abnehmende Colokalisation der STRIPAK-Komponenten mit dem ER, der Kernhülle, den Mitochondrien und untereinander während des filamentösen Wachstums deutet auf die Auflösung des Komplexes in Subkomplexe in Filamenten hin. LC-MS-Messungen bestätigten zudem UMAG_02960 als strukturgebende Untereinheit, UMAG_10198 als katalytische Untereinheit und UMAG_00493 als Kinaseaktivator des STRIPAK-Komplexes in U. maydis. Außerdem konnten durch die LC-MS-Messung weitere potenzielle Interaktionspartner des STRIPAK-Komplexes in U. maydis identifiziert werden. Dazu gehören Proteine der Fettsäuresynthese, Proteinbiosynthese und Ergosterolbiosynthese. Da Ergosterol eine wichtige Rolle in der Fluidität und Permeabilität der Plasmamembran spielt, ist die reduzierte Integrität der Plasmamembran nach Deletion des Ankerproteins auf den Einfluss des STRIPAK-Komplexes auf die Ergosterolbiosynthese zurückzuführen.
Abstract (englisch):
The striatin-interacting phosphatase and kinase complex (STRIPAK complex) is highly conserved in eucaryotes. In mammals the complex regulates the organisation of the cytoskeleton, cell migration and cell morphology. In fungal cells STRIPAK influences sexual development, growth, and cell fusion. The main components of STRIPAK are kinases, tail-anchored proteins, developmental proteins, and the phosphatase which consists of the regulatory, the catalytic and the structural subunit. The regulatory subunit is a striatin-homolog and mediates the interaction of the tail-anchored protein and the developmental protein and thereby works as the inner framework of the complex. ... mehrThe tail-anchored protein ensures the localisation at the membrane of the mitochondria or the nucleus. The developmental protein is linked to internal membrane systems.
The STRIPAK complex was already analysed in some ascomycetes and the biotrophic, plant pathogenic model organism Ustilago maydis is the first basidiomycete wherein STRIPAK is now investigated in. Like in the deletion of any of the STRIPAK components in Saccharomyces cerevisiae the deletion of the tail-anchored protein in U. maydis lead to a premature return of the pheromone dependent cell cycle arrest. The reduced number of vacuoles after the deletion of the tail-anchored protein in U. maydis shows the influence of the STRIPAK complex on the vacuoles, which could also be observed in S. cerevisiae due to an abnormal vacuole morphology as a result of the deletion of the tail-anchored protein. The deletion of the tail-anchored protein in U. maydis also resulted in defects in the fusion of conjugation tubes similar to the fusion defects found after the deletion of one of the main components of the STRIPAK complex in Sordaria macrospora. The length of b-dependent filaments was also reduced after the deletion of the tail-anchored protein in U. maydis, which is similar to the phenotype of the deletion of any of the components of the STRIPAK complex in Neurospora crassa resulting in a reduced growth rate. Additionally, deletion of the tail-achored protein in U. maydis lead to cytokinesis and polarity defects, apathogenicity related to absent adhesion to the plant surface, reduced cell wall and plasma membrane integrity and a reduced amount of motile early endosomes. Uniquely, the regulatory subunit and the developmental protein were found to be essential in U. maydis. Because of the deletion phenotype, a connection of the STRIPAK complex with Cla4, Smu1 and UmSepA, proteins of the Cdc42-Rac1-pathway is assumed. In U. maydis hyphal fusion, endocytosis, cytokinesis, polarity, and filamentous growth is regulated by the Cdc42-Rac1-pathway. A role of the STRIPAK complex antagonizing the TORC2 complex like it was described for S. cerevisiae is hypothesized because of the reduced cell wall and plasma membrane integrity after the deletion of the tail-anchored protein and the function of TORC2 in activating the cell wall integrity pathway. The tail-anchored and the developmental protein were localized to the nuclear membrane, and mitochondria in sporidia of U. maydis by fluorescence microscopy. In Sporidia, the regulatory subunit of the phosphatase was localized to the ER, nuclear membrane, and mitochondria, which resembles the localization of the STRIPAK complex in ascomycetes. A colocalization of those three components was also shown in sporidia by fluorescence microscopy. Interactions of the regulatory subunit, the tail-anchored protein and developmental protein were proven in sporidia by co-immunoprecipitation and therefore the three components were confirmed as part of the STRIPAK complex in U. maydis. The decreasing colocalization of the STRIPAK components with the ER, the nuclear membrane, the mitochondria, and with each other during filamentous growth indicates the dissolution of the STRIPAK complex into subcomplexes in filaments. LC-MS measurements confirmed UMAG_02960 as the scaffolding subunit, UMAG_10198 as the catalytic subunit and UMAG_00493 as the kinase activator of the STRIPAK complex in U. maydis. Additionally, more potential interaction partners of the STRIPAK complex in U. maydis were identified by LC-MS measurements. These include proteins involved in fatty acid synthesis, protein biosynthesis and ergosterol biosynthesis. Since ergosterol plays an important role in the fluidity and permeability of the plasma membrane, the reduced integrity of the plasma membrane after deletion of the anchor protein is due to the influence of the STRIPAK complex on ergosterol biosynthesis.
