Hexapod-basierte dreidimensionale konfokale Hornhautmikroskopie zur Charakterisierung stromaler Nerven

Fragestellung: Korneale Nerven spielen die entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung von Gesundheit und Empfindlichkeit der Hornhaut sowie beim Blinzelreflex, der Tränenfilmproduktion und dem Schutz der Augenoberfläche. Die Visualisierung dieser peripheren Nerven in der dicht innervierten Kornea beschränkt sich aber auf 2D-Einzelbilder mit kleinem Sichtfeld oder auf das Zusammenfügen solcher Bilder aus der zentralen Kornea. Im Gegensatz zum subbasalen Nervenplexus ist über die 3D-Struktur der stromalen Nerven wenig bekannt. In diesem Beitrag soll ein räumliches, großvolumiges Nervenmodell vom Schweineauge erstellt werden.
Methodik: In der ersten Entwicklungsstufe werden mit einem stationären konfokalen Laserscanningmikroskop mit einem Sichtfeld von 300 × 300 μm² und 30 Bildern pro Sekunde hochauflösende Korneabilder aufgenommen. Ein selbst programmierter Hexapod (6-Achsen Verschiebetisch) mit eigens entwickeltem Bulbushalter positioniert die Schweineaugen während der Bildaufnahme nach einem vordefinierten Schema, so dass parallel orientierte, überlappende Volumina von 300 × 300 × 1000 μm³ entstehen. Diese werden mit einem selbst entwickelten elastischen Algorithmus rekonstruiert und mit dem Grid/Collection Stitching Plugin von ImageJ zusammengesetzt. ... mehrZehn enukleierte Schweineaugen wurden wenige Stunden post mortem unter den gleichen Bedingungen untersucht.
Ergebnis: Die Rekonstruktion von stromalen Nervengeflechten gelang in großen Korneavolumina mit einem Sichtfeld von 1,1 × 1,1 mm über die gesamte Hornhautdicke. Dafür waren Raster von fünf mal fünf Volumenstapeln bei einer Überlappung von 50 μm erforderlich. In einem resultierenden Volumen wurden weiterhin die stromalen Nerven manuell segmentiert, um eine dreidimensionale Darstellung des stromalen Nervengeflechts zu erhalten. Eine automatisierte Segmentierung des Nervengeflechts ist Bestandteil der aktuellen Forschung.
Schlussfolgerung: Die Kombination von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und Hexapod-Bewegung ermöglicht große Korneavolumina aufzunehmen. Die stromalen Nerven können nachverfolgt und perspektivisch quantifiziert werden. Bislang erfolgen nur lineare Hexapodbewegungen. Für größere Rekonstruktionen müssen die Rotationsbewegungen wegen der Korneakrümmung und des begrenzten Arbeitsabstands des Mikroskopobjektivs hinzugefügt werden. Im Vergleich zu etablierten zweidimensionalen Komplettpräparaten der Kornea liefert unsere Darstellung echte dreidimensionale Daten mit in vivo Potenzial.