Comparison of Different Transmembrane Substrates of Intramembrane Proteases by NMR Spectroscopy

In dieser Arbeit wurden zwei Substrate von Aspartat-Intramembran-Proteasen untersucht. Die Transmembrandomäne (TMD) von Notch1 ist ein Substrat von γ-Sekretase und Notch1 an der Zellkommunikation, der Entscheidung über die Zellbestimmung während der Entwicklung und der Neurogenese beteiligt. Die TMD des Tumornekrosefaktors α (TNFα) ist ein Substrat der Signalpeptid Peptidase ähnlichen Protease 2a (SPPL2a) und TNFα, vermittelt Apoptose oder Zellüberleben und ist an Entzündungsreaktionen beteiligt.
Die erstaunlichen Intramembran-Proteasen, die die TMD von Substraten innerhalb der hydrophoben Umgebung der Lipiddoppelschicht spalten, wurden in den letzten Jahrzehnten intensiv untersucht. ... mehrProtease-Strukturen und mechanistischen Aspekte wurden aufgeklärt, dennoch bleiben viele Fragen unbeantwortet, insbesondere hinsichtlich der Substratauswahl. Eine kryogene Elektronenmikroskopie-Struktur (kryo-EM) des Notch1-γ-Sekretase-Komplexes hat bahnbrechende mechanistische Erkenntnisse geliefert. Die helikale C-terminale Transmembrandomäne (TM-C) in Notch1 ist aufgewunden und bildet einen β-Strang aus, der durch Interaktion mit einem antiparallelen β-Faltblatt in Presenilin 1 (PS1), der katalytischen Untereinheit von γ-Sekretase, ein hybrides β-Faltblatt formt. Diese Wechselwirkung stabilisiert den aktiven Notch1-γ-Sekretase-Komplex und positioniert ihn in einer spaltungsfähigen Orientierung.
Keine der Intramembran-Proteasen scheint eine Konsensussequenz zu erkennen, dennoch werden Substrate an bestimmten Spaltstellen geschnitten und Mutationen in der Substrat Transmembrandomäne (TMD) beeinflussen die Prozessivität. Basierend auf Mutationsergebnissen wurde eine Flexibilitäts-Hypothese entwickelt, die eine flexible Substrat TMD für eine effiziente Spaltung voraussetzt, jedoch nicht durch strukturelle und dynamische Daten bestätigt wurde. Diese Arbeit untersucht, wie Mutationen, die die TMD-Stabilität ändern, die strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Notch1 und TNFα beeinflussen, welchen Einfluss diese Eigenschaften auf die Prozessivität haben und welche Substrat-Anforderungen sich von dem Einfluss der strukturellen und dynamischen Eigenschaften ableiten lassen. Ein nahes Homolog von Notch1, das Transmembran-Protein Notch3, welches im Vergleich zu Notch1 nur mit einer Effizienz von 25 % gespalten wird, wird ebenfalls in die Analyse einbezogen.
Alle Strukturuntersuchungen wurden in Trifluorethanol/Wasser, dessen Polarität annähernd das Innere der wasserhaltigen Protease nachahmt, durchgeführt. Chemische Verschiebungen sowie abstandsbasierte NOE-Daten, die mit Standard-NMR-Methoden bestimmt wurden, wurden zur Charakterisierung der Sekundärstruktur und Berechnung der 3D Strukturen verwendet. Zur Bestimmung der Dynamik und restespezifischen Stabilitätsprofile wurden Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Messungen durchgeführt. Um die Wechselwirkung zwischen Substrat und Enzym abschätzen zu können, wurde ein einfaches Modell der Überlagerung der untersuchten Strukturen mit der kryo-EM Struktur des Notch1-γ-Sekretase-Komplexes oder mit der vorhergesagten TNFα-SPPL2a-Komplex Struktur angewendet.
Die 3D Struktur zeigte eine α-helikale und leicht gebogene Notch1 TMD, bei der die Orientierung der N-terminalen TMD (TM-N) bezogen auf die TM-C auf einen konischen Bereich beschränkt war, wenn 40 NMR-Strukturen mit niedrigster Energie in einem Strukturbündel dargestellt wurden. Wasserstoffbrückenbindungen stabilisierten den zentralen Teil der TMD, wobei die S3 Schnittstelle sowie umgebende Reste durch schwächere Wasserstoffbrückenbindungen und eine teilweise Entfaltung gekennzeichnet waren. Notch1L1740-1743 stabilisierte und Notch1G1740-1743 destabilisierte die TM-N, wohingegen Notch31642-1665 die TM-C stabilisierte.
Die Überlagerung der Strukturbündel mit der kryo-EM Struktur des Notch1-γ-Sekretase-Komplexes zeigte, dass das untersuchte Notch1 Bündel gut in das aktive Zentrum des Enzyms passte und die TM-C Enden in Richtung des antiparallelen β-Faltblattes in PS1 zeigten. Dies lässt auf eine Interaktion mit dem Enzym schließen. Wegen der geraderen TMD und einer geänderten Richtung der Biegung in Notch1L1740-1743 TMD als auch der noch geraderen Struktur und stärker geänderten Richtung der Biegung in Notch31642-1665 TMD, gruppierten sich die TM-Cs weiter entfernt von dem β-Faltblatt in PS1, was die benötigte Interaktion mit PS1 hindern und mit der verminderten Spaltbarkeit korrelieren könnte. Die konformationell weniger eingeschränkte Notch1G1740-1743 TMD könnte den Zugang zum aktiven Zentrum und die spaltungskonforme Positionierung erleichtern, wodurch die Prozessivität erhöht werden könnte.
Die α-helikale Struktur von TNFα TMD war ebenfalls leicht gebogen und die Orientierung der TM-N im Vergleich zur TM-C auf einen definierten Konus beschränkt, wenn die Strukturen als Bündel dargestellt wurden. Der zentrale Teil der TMD war weniger stabil und daher flexibler. An den Schnittstellen wurde die Helix durch schwächere Wasserstoffbrückenbindungen und einer teilweisen Entfaltung unterbrochen. Während TNFαS34P28-60 etwas flexibler war als TNFα WT, war die gesamte TMD in TNFαAGA/LLL28-60 stabiler, insbesondere im mittleren Teil. Das untersuchte TNFα Strukturbündel passte gut in das aktive Zentrum des von AlphaFold vorhergesagten Modells von SPPL2a. Hier gruppierten sich die TM-C Enden um das mutmaßliche antiparallele β-Faltblatt in SPPL2a. Die TM-C Enden befanden sich in TNFαAGA/LLL28-60 aufgrund einer geraderen TMD und einer geänderten Richtung der Biegung weiter vom β-Faltblatt in SPPL2a entfernt. In TNFαS34P28-60 war die Biegung noch weniger ausgeprägt und die Verteilung der Orientierungen im Bündel gruppierte sich um die Helixachse, weshalb sich die TM-C Enden weiter entfernt vom β-Faltblatt, aber näher an den katalytischen Aspartate befanden. Dies könnte die Ausbildung eines tetraedrischen Zwischenprodukts ermöglichen und somit die Spaltung erleichtern.
Die Analyse meiner Daten führte zur Feststellung, dass Mutationen die strukturellen und dynamischen Eigenschaften der TMD und dadurch verschiedene mechanistische Schritte und die Prozessivität beeinflussen. Die TMD erfordert eine gewisse Flexibilität um in das Innere des Enzyms und zum aktiven Zentrum zu gelangen. Des Weiteren ist die Bildung eines hybriden β-Faltblattes von entscheidender Bedeutung für die Effizienz der Spaltung und ist abhängig von der Stabilität der Substrat TM-C sowie der Ausprägung und Ausrichtung der Biegung in der Substrat TMD. Die Stabilität der Substrat TM-C ist ebenfalls wichtig für die Entfaltung der Schnittstelle und die Zugänglichkeit der zu spaltenden Peptidbindung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass weder die Tendenz zur Ausbildung eines β-Stranges, noch die Flexibilität innerhalb der TMD und der Schnittstellen oder die Ausrichtung und Ausprägung der TMD Biegung für sich genommen ausschließlich substratbestimmend sind, sondern zur Anpassung der Spaltungseffizienz kombiniert und auf die biologischen Ansprüche des Substrats zugeschnitten werden können.

In this thesis, two substrates of intramembrane aspartate proteases were investigated. The transmembrane domain (TMD) of Notch1 is a γ-secretase substrate and Notch1 is involved in cell communication, cell-fate decisions during development and neurogenesis. TMD of Tumor necrosis factor α (TNFα) is a substrate of signal peptide peptidase like protease 2a (SPPL2a) and TNFα mediates apoptosis or cell survival as well as is involved in inflammation.
The astonishing intramembrane proteases, which cleave the single-span TMD of substrates within the hydrophobic environment of the lipid bilayer, have been intensively investigated over the last decades. ... mehrProtease structures and mechanistic aspects have been revealed, but many questions remain unanswered, especially regarding substrate selection. A cryogenic-electron microscopy (cryo-EM) structure of the Notch1–γ-secretase complex has provided ground-breaking mechanistic insights. The helical C-terminal transmembrane domain (TM-C) in Notch1 is unwound and adopts a β-strand, which forms a hybrid β-sheet by interacting with an antiparallel β-sheet in presenilin 1 (PS1), the catalytic subunit of γ-secretase. This stabilizes the active Notch1-PS1 complex and positions them in a cleavage competent orientation.
None of the intramembrane proteases seems to recognize a consensus sequence, nevertheless substrates are cleaved at specific cleavage sites and mutations in the substrate TMD affect their processivity. A flexibility hypothesis has been developed based on mutational results, assuming a flexible substrate TMD for efficient cleavage, but has not been corroborated with structural and dynamic data. This thesis investigates and compares how mutations that alter TMD stability, affect structural and dynamic properties of Notch1 and TNFα, what influence these properties have on processivity, and which substrate requirements can be derived from these influences. A close homologue of Notch1, Notch3, which is cleaved only to 25 % efficiency compared with Notch1, is also included in the analysis.
All structural investigations were carried out in trifluorethanol/water, whose polarity approximately mimics the water containing protease interior. Chemical shifts as well as distance-based NOE data, determined by standard NMR methods, were used to characterize the secondary structure, and 3D structures were calculated with these data as restraints. Hydrogen deuterium exchange measurements were performed to determine the dynamics and residue-specific stability profiles. Furthermore, a simple model of superimposing the investigated structures on the Notch1-γ-secretase cryo-EM structure or a predicted TNFα-SPPL2a structure was applied to evaluate the interaction between the substrate and enzyme.
The 3D structure revealed an α-helical and slightly bent Notch1 TMD, where the orientation of the N-terminal TMD (TM-N) with respect to the TM-C was restricted to a conical region, when 40 low energy NMR structures were represented in a bundle. Hydrogen bonds stabilized the central TMD around Leu1747 and S3 cleavage site together with surrounding residues were characterized by weaker hydrogen bonds and partial unfolding. Notch1L1740-1743 stabilized, while Notch1G1740-1743 destabilized the TM-N, whereas Notch31642-1665 stabilized the TM-C compare to Notch1.
Superposition of the structural bundles onto the cryo-EM structure of Notch1-γ-secretase complex showed that the investigated Notch1 bundle fitted well in the enzymes active site and the TM-C ends showed towards the antiparallel β-sheet in PS1, indicating an interaction with the enzyme. Due to the straighter TMD and shifted bend in Notch1L1740-1743 and even straighter structure and more shifted bend in Notch31642-1665 TMD, their TM-Cs clustered more distantly from the β-sheet in PS1, what might hinder the required interaction with PS1 and correlated with reduced cleavability. The conformational less restricted Notch1G1740-1743 TMD might facilitate the access to the active site and the cleavage conform positioning, thereby increasing processivity.
The α-helical structure of TNFα TMD was also slightly bent and the orientation of the TM-N with respect to TM-C limited to a defined cone, when represented as structural bundle. The central part of the TMD was less stable, thus more flexible. At the cleavage sites the helix was disrupted by weaker hydrogen bonds and partial unfolding. While TNFαS34P28-60 was slightly more flexible than TNFα, the entire TMD was more stable in TNFαAGA/LLL28-60, especially in the central part. The investigated TNFα bundle fitted well into the active site of the AlphaFold derived model of SPPL2a. Here, the TM-C ends clustered around the putative antiparallel β-sheet in SPPL2a. TM-C ends in TNFαAGA/LLL28-60 were located more distantly from the β-sheet in SPPL2a because of a straighter TMD and shifted direction of the bend. In TNFαS34P28-60 the bend was even less pronounced and the distribution of orientations in the bundle clustered around the helical axis, therefore TM-C ends were further away from the β-sheet in SPPL2a but directed closer towards the catalytic aspartates that might enable the formation of a tetrahedral intermediate and facilitating cleavage.
The analysis of my data lead to the conclusion that mutations affect the structural and dynamic properties and thus different mechanistic steps and the processivity. The TMD requires a certain flexibility to enter the interior of the enzyme and translocate to the active site. Furthermore, formation of a hybrid β-sheet is crucial and depends on the stability of the substrate TM-C, the extend and orientation of the bend. Substrate TM-C stability is also important for unfolding of the cleavage site and accessibility of the scissile peptide bond.
In summary, neither the propensity to adopt a β-strand, nor flexibility within the TMD and cleavage sites or the orientation and extend of the TMD bend are exclusively substrate-determining on their own, but can be combined to adjust the cleavage efficiency and create a substrate customised to the biological needs.