The Role of Glial Cells During Differentiation of Mouse Retinal Organoids

Die Retina ist das Sinnesorgan, welches für die Aufnahme visueller Reize verantwortlich ist. Sie besteht aus sechs retinalen Neuronen und einem Glia-Zelltyp. Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren detektieren einfallende Photonen und wandeln die Information in elektrochemische Signale um. Interneuronen umfassen bipolare Zellen, amakrine Zellen, horizontale Zellen und Ganglienzellen. Sie übernehmen die erste Verarbeitung der Informationen in der Retina und leiten diese anschließend innerhalb der Retina oder über den Sehnerv an das Gehirn weiter.
Um die Entwicklung der Retina und deren Erkrankungen in einem In vitro-Modell erforschen zu können, wurden retinale Organoide (RO) entwickelt. ... mehrDiese stellen eine Alternative zu Tiermodellen dar. RO ähneln der Retina in vielerlei Hinsicht und bilden die frühen Entwicklungsprozesse der Retinogenese nach. Dazu gehört die Entstehung aller retinalen Zelltypen aus multipotenten Vorläuferzellen sowie die Schichtung der Zellen entsprechend ihrer Position in der Retina. Die Kultivierungsdauer von RO ist jedoch begrenzt, die Schichtung weist eine mangelnde Komplexität auf und Müller-Gliazellen bleiben unreif und in geringer Anzahl. Andere Glia-Zellen, wie retinale Astrozyten und Mikroglia, fehlen vollständig. Glia-Zellen sind dynamische und aktive Bestandteile der Retina und reagieren auf physiologische und pathologische Reize, was ihre Bedeutung für die Funktion des Auges unterstreicht. Da die Differenzierung von RO auf Parametern beruht, die ihre Entwicklung in vivo nachahmen, zielte diese Arbeit auf die Co-Kultur retinaler Neuronen mit Glia-Zellen ab.
Zunächst wurde das Protokoll zur Herstellung von RO etabliert. Die RO wurden hinsichtlich der Zellzahlen und der apico-basalen Verteilung der Neuronen im Epithel charakterisiert und die Abwesenheit von Müller-Glia bestätigt. Um das Fehlen der Glia-Zellen auszugleichen, wurden Experimente entworfen, die die Integrität der Organoide nicht beeinträchtigen, aber die Unterstützung durch Glia-Zellen ermöglichen. Dazu gehörte die Aktivierung des Notch-Signalwegs, um den Anteil von differenzierenden Glia-Zellen in den RO zu erhöhen. Parallel dazu wurde ein Protokoll zur Isolation kortikaler Astrozyten aus Mäusen etabliert. Diese wurden für Co-Kultur-Ansätze verwendet, bei denen primäre Astrozyten mit freischwimmenden RO kombiniert wurden. Das Kulturmedium wurde zugunsten der RO gewählt, weshalb negative Auswirkungen auf das Sekretionsverhalten der Astrozyten nicht ausgeschlossen werden konnten. Darum wurden die RO zusätzlich mit konditioniertem Medium behandelt. Die Co-Kultur führte zu keiner Veränderung der Anzahl oder der apico-basalen Schichtung der Neuronen. Durch das konditionierte Medium verursachte Veränderungen wurden auf Unterschiede zwischen den Kulturmedien der RO und der Astrozyten zurückgeführt.
Um Zell-Zell-Kontakte zwischen den retinalen Zellen und den Astrozyten zu ermöglichen, wurden die RO dissoziiert und zusammen mit Astrozyten reaggregiert. Reaggregierte RO zeigten in Bezug auf ihre Zusammensetzung und Schichtung Ähnlichkeiten zu den regulären RO, wie durch Immunfärbungen nachgewiesen wurde. Die Integration von Astrozyten in reaggregierte RO führte jedoch zum Verlust der epithelialen Organisation. Um dem entgegenzuwirken, wurde eine künstliche basale Seite durch die Integration eines „Gliakernes“ eingeführt, welcher die basalen retinalen Astrozyten der Retina nachahmt. Die Bereitstellung von basalen Signalen konnte die epitheliale Struktur jedoch nicht wiederherstellen, weshalb die Astrozyten eventuell für die Integration nicht geeignet sind.
Zusammenfassend wurden Co-Kultur-Ansätze mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen etabliert, die aber keinen positiven Effekt auf die Kultivierung retinaler Zellen zeigten. Die im Verlauf dieser Experimente etablierte Methode zur Herstellung von reaggregierten RO ist dennoch ein vielversprechendes Modell zur Untersuchung der neuroepithelialen Organisation.

The retina is the sensory organ required for the collection of visual stimuli. It consists of six basic retinal neurons and one supporting glia cell type. Rod and cone photoreceptors detect incoming photons and translate the information into electrochemical cues. Interneurons include bipolar cells, amacrine cells, horizontal cells, and ganglion cells. They perform first processing in the retinal neuronal network and transmit the information inside the retina or to the brain via the optic nerve.
To facilitate the study of retinal development and disease progression in an in vitro model, organoids were established, which reduced some of the drawbacks of animal models. ... mehrRetinal organoids (RO) resemble the retina in many ways and recapitulate the early developmental processes involved in retinogenesis. Similarities include the generation of all retinal cell types from multipotent progenitors as well as the layering of the cells according to their in vivo positioning. Nevertheless, the cultivation time of ROs is limited, the layering lacks complexity, and Müller glia remain immature and in low numbers. Other support cells, like retinal astrocytes and microglia, are completely absent. Retinal glia cells are dynamic and active participants in the retina's response to physiological and pathological stimuli, highlighting their importance in the overall sensory function of the eye. Since the differentiation of ROs relies on parameters that mimic their in vivo development, co-cultivation of retinal neurons with supporting glia cells was targeted in this work.
First, the protocol for the generation of ROs was established. The ROs were characterised with regard to the cell numbers and distribution of neurons in the tissue and to confirm the possible absence of glia cells. To substitute for the lack of support cells, experiments were designed that did not disrupt organoid integrity but enabled glia-mediated support. This included targeting intercellular signalling via Notch ligands to increase the portion of glia cells in the developing ROs. In parallel, the procedure to isolate cortical astrocytes from mice was established. They were used for co-cultivation approaches combining a confluent monolayer of primary astrocytes with free-floating ROs. The culture medium was kept in favour of the ROs, and even though the astrocyte morphology was not altered, negative effects on their secretion behaviour could not be excluded. Thus, conditioned medium from astrocyte cultures was collected to treat ROs with potential secreted factors. In the co-cultivation experiments conducted, changes in neuron numbers or their apico-basal layering were not observed. The astrocyte conditioned medium did not improve the culture conditions and alterations were rather allocated to variations between the culture medium of ROs and astrocytes.
To enable cell-cell contact-mediated signalling between the retinal cells and the astrocytes, the ROs were dissociated, and reaggregated together with astrocytes. Reaggregated ROs showed similarities to the regular cultured ROs in regard to their cellular composition and organisation, as shown by immunocytochemical staining. The integration of astrocytes into reaggregated ROs, however, resulted in the loss of neuroepithelial organisation. To counter this loss of structure, an artificial basal side was introduced by the integration of a “glia core”, mimicking the retinal astrocytes residing in the ganglion cell layer in vivo. Providing basal cues to facilitate the reorganisation of retinal cells did not rescue the epithelial structure, and it was therefore concluded that the cell type was not suited for the perused goal.
In summary, co-cultivation approaches targeting multiple mechanisms of action were established but could not provide beneficial environmental cues that improved RO cultures. In the course of these experiments, the established method for the reaggregation of ROs is nevertheless a promising model to investigate neuroepithelial reorganisation and could pave the way for further co-cultivation studies with potentially advantageous cell types.