The Role of the Neural Cell Adhesion Molecule Ncam1b during Development and Regeneration of the Zebrafish Lateral Line System = Die Rolle des Neuronalen Zelladhäsionsmoleküls Ncam1b während der Entwicklung und Regeneration des Seitenliniensystems im Zebrafisch

Haarsinneszellen (HSZ) sind für die Schallwahrnehmung und -weiterleitung unerlässlich. Allerdings sind diese Zellen im adulten Säugerinnenohr normalerweise nicht regenerationsfähig, was zu irreversiblem Hörverlust führt. Die Entschlüsselung der Mechanismen der Haarzellentwicklung und -regeneration ist daher ein wichtiges Ziel für die Entwicklung von Therapien zur Wiederherstellung des Gehörs.
Die HSZ des adulten Säugerinnenohrs sind funktionell homolog zu den HSZ des mechanosensorischen Seitenlinienorgans aquatischer Wirbeltiere wie dem Zebrafisch, das Wasserbewegungen und Vibrationen wahrnimmt. ... mehrDer Zebrafisch erweist sich als äußerst gutes Modellsystem, da er über die bemerkenswerte Fähigkeit verfügt, Haarzellen im oberflächennahen posterioren Seitenlinienorgan zu regenerieren.
Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Rolle des neuronalen Zelladhäsionsmoleküls Ncam1b in der Entwicklung und Regeneration des posterioren Seitenlinienorgans (pSLO). NCAM, im Allgemeinen, ist essentiell für die neuronale Entwicklung und ermöglicht organisierte Zellmigration, Axonwachstum und Faszikulation. Infolge einer Genomduplikation im Zebrafisch entstanden die Paraloge Ncam1a und Ncam1b. Frühere Studien zeigten, dass ein Morpholino-Knockdown von ncam1b schwerwiegende Auswirkungen auf die pSLO-Entwicklung hat, wie reduzierte Primordiumgröße, Neuromastenzahlen und Migrationsdistanz. Dies wird auf die Interaktion von Ncam1b mit dem FGF-Rezeptor Fgfr1a im Primordium und die daraus resultierende gestörte Proliferation zurückgeführt.
In der aktuellen Studie wurden CRISPR/Cas9-induzierte ncam1b-Mutanten im Zebrafisch erzeugt und analysiert, da anhaltende Zweifel an der Aussagekraft von Morpholino-Knockdown-Ansätzen bestehen. Überraschenderweise verursachte der Knockout von ncam1b nicht die gleichen Effekte wie der Knockdown. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf genetische Kompensationsmechanismen zurückzuführen, die durch die Hochregulation von Genen wie dem ncam1a-Paralog oder l1cam in ncam1bMutanten belegt wurden. Obwohl ncam1b-Mutanten während der pSLO-Entwicklung keine schweren morphologischen Defekte aufwiesen, zeigten molekulare Analysen, dass Ncam1b das Gleichgewicht zwischen den Wnt- und FGF-Signalwegen innerhalb des pSLO-Primordiums orchestriert. Dies äußerte sich lokal in einer gestörten räumlichen Verteilung proliferierender Zellen, während die Gesamtzahl unverändert blieb. Ncam1b wird zwar während der pSLO-Entwicklung in HSZ exprimiert, ncam1bMutanten zeigten jedoch keine Probleme in der Entwicklung von HSZ. Allerdings führte der ncam1b Knockout zu einer beeinträchtigten Regeneration von HSZ nach Neomycin-induzierter Schädigung.
ncam1b Mutanten zeigten eine Ansammlung proliferierender Stützzellen, die sich nicht ordnungsgemäß zu HSZ differenzierten. Aus der Tatsache, dass dieser ncam1b-Mutanten-Phänotyp durch DAPTvermittelte Notch-Inhibition gerettet werden konnte, wird vermutet, dass Ncam1b den Notch-Signalweg moduliert, um das Gleichgewicht zwischen Stützzellproliferation und Differenzierung von HSZ zu koordinieren. Dies könnte über die Bindung von Ncam1b an Fgfr1a erreicht werden. Im Gegensatz zur pSLO-Entwicklung, bei der Ncam1a wahrscheinlich eine Schlüsselrolle bei der genetischen Kompensation spielt, schien Ncam1a nicht als Kompensator während der Regeneration in ncam1b-Mutanten beteiligt gewesen zu sein.
Zusammenfassend deuten die Mutantenanalysen auf zwei unterschiedliche Funktionen von Ncam1b im pSLO des Zebrafischs hin. Während es an der Regulation der Zellproliferation während der embryonalen Entwicklung beteiligt ist, spielt es eine Rolle bei der Initiierung der Differenzierung von HSZ während des Regenerationsprozesses in reifen Neuromasten.

Sensory hair cells (HCs) are essential for sound perception and transmission in the mammalian ear.
The inability of the adult mammalian inner ear to regenerate HCs after damage leads to irreversible hearing loss. Unlocking the mechanisms of HC development and regeneration is therefore a key goal for developing therapies to restore hearing. HCs of the mammalian inner ear are functionally homologous to the HCs found in the mechanosensory lateral line system of aquatic vertebrates like zebrafish, which detects water movements and vibrations. The zebrafish provides a powerful model system in this regard, as it possesses an amazing ability to regenerate HCs in the superficially located posterior lateral line organ (pLLO).
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The present study focuses on the role of the neural cell adhesion molecule Ncam1b in the development and regeneration of the posterior lateral line system (pLLS). NCAM in general is essential for neuronal development; it facilitates cell-cell contacts that enable organized cell migration, axon growth, and fasciculation. In zebrafish, Ncam1 has two paralogs, Ncam1a and Ncam1b, which arose from a genome duplication event. Previous studies in our lab have demonstrated that a morpholino knockdown of ncam1b has severe consequences for the development of the pLLS [Dries et al., 2021]. Reductions in primordium size, neuromast numbers, and migration distance were observed. These anomalies are attributed to the fact that Ncam1b interacts with FGF receptor Fgfr1a in the Trailing Zone of the primordium. After ncam1b knockdown, FGF signaling is reduced in this area, leading to disrupted proliferation. These findings underscore the central role of Ncam1b in the formation of pLLS in zebrafish.
In the current study, CRISPR/Cas9-induced ncam1b mutants were generated, because of ongoing controversies surrounding the reliability of morpholino knockdown approaches. Surprisingly, the knockout of ncam1b did not cause the same effects as the knockdown with morpholinos. This discrepancy is likely attributed to genetic compensation mechanisms, evidenced by the upregulation of genes like the ncam1a paralog or l1cam in ncam1b mutants. While ncam1b mutants did not show severe morphological defects during pLLS development, molecular analyses revealed that Ncam1b orchestrates the balance between Wnt and FGF signaling pathways within the primordium. This was obvious by a disrupted spatial distribution of proliferating cells in the primordium. The total number of proliferating cells, however, remained unaltered.
Although Ncam1b is expressed in HCs during pLLO development, HC development proceeded unaffected in ncam1b mutants. Ncam1b is, however, crucial for HC regeneration after neomycin-induced damage.
The absence of ncam1b led to an accumulation of proliferating support cells that failed to differentiate properly into HCs. Since the ncam1b mutant phenotype could be rescued by DAPT-mediated Notch inhibition, it is assumed that Ncam1b modulates the Notch signaling pathway to coordinate the balance between support cell proliferation and HC differentiation. This may be achieved via Ncam1b binding to Fgfr1a. In contrast to pLLS development, where Ncam1a likely plays a key role in genetic compensation, Ncam1a did not appear to be involved in compensating for the loss of Ncam1b during regeneration in ncam1b mutants.
The mutant analyses suggest that Ncam1b serves two distinct functions in the pLLS of zebrafish. On one hand, it regulates cell proliferation during development, while on the other hand, it triggers HC differentiation during regeneration in mature neuromast structures.