Cyclopropene für die duale bioorthogonale Markierung von DNA

In den letzten Jahrzehnten hat sich die bioorthogonale Markierung zu einem wertvollen Instrument für unser Verständnis von Lebewesen und deren biologischen Prozessen entwickelt, da sie es ermöglicht Biomoleküle in vivo zu visualisieren. Aufgrund der enormen Komplexität von biologischen Systemen ist jedoch für deren Untersuchung die Verfolgung eines einzelnen Biomoleküls häufig nicht ausreichend. Stattdessen ist die simultane Visualisierung mehrerer Zielmoleküle nötig. Die Durchführung von zwei oder mehreren bioorthogonalen Markierungen in der gleichen Umgebung bleibt jedoch aufgrund von unerwünschten Kreuzreaktionen eine Herausforderung. ... mehrIm Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode für die duale bioorthogonale Markierung von DNA in der Zelle mit Hilfe zwei isomerer Cyclopropene als chemische Reporter entwickelt. Hierbei wurde zunächst eine kleine Bibliothek 1-methylcyclopropenmodifizierter 2‘-Desoxynukleoside mit unterschiedlicher Linkerstruktur synthetisiert und diese in einer bioorthogonalen Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf angewendet. Diese Reaktion konnte anschließend orthogonal zu einer Photoclick-Reaktion von 3-methylcyclopropenmodifizierten 2‘-Desoxynukleosiden mit einem Tetrazol durchgeführt und so eine Grundlage für die Anwendung zur dualen Markierung in vitro erarbeitet werden. Es wurden anschließend die entsprechenden cyclopropenmodifizierten 2‘-Desoxynukleosid-triphosphate synthetisiert und diese in Primerverlängerungsexperimenten eingesetzt. Hierbei konnten sowohl 1- als auch 3-methylcyclopropenmodifiziete Derivate von den getesteten Polymerasen akzeptiert und enzymatisch in DNA eingefügt werden. Eine nachfolgende postsynthetische Markierung des 1-methycyclopropenmodifizierten Oligonukleotids durch Reaktion mit einem Cyanin-Styryl-Tetrazin-Konjugat ließ sich innerhalb von Minuten erzielen. Abschließend wurde die Fluoreszenzmarkierung von genomischer DNA in HeLa-Zellen über die beiden unterschiedlichen bioorthogonalen Reaktionen nach metabolischer Inkorporation der cyclopropenmodifizierten Substrate von den zelleignen Enzymen demonstriert. Durch Kombination aller nötigen intrazellulären Transport- und Markierungsschritte konnte abschließend auch erstmals die duale bioorthogonale Markierung der zellulären DNA über orthogonale Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf und Photoclick-Reaktion gezeigt werden. Das hierbei erarbeitete Protokoll stellt eine Grundlage für die Entwicklung neuer Markierungsstrategien dar, welche zukünftig die Untersuchung von Funktionsweise und auch der Interaktion von Nukleinsäuren auf molekularer Ebene in vivo ermöglichen kann.

Over the last decades, bioorthogonal labeling has become a valuable tool for our understanding of living organisms and their biological processes, as it allows us to visualize biomolecules in vivo. However, due to the enormous complexity of biological systems, tracking a single biomolecule is often not sufficient for their investigation. Instead, the simultaneous visualization of several target molecules is necessary. However, performing two or more bioorthogonal labeling in the same environment remains a challenge due to unwanted cross-reactions. In this work, a method for dual bioorthogonal labeling of DNA in the cell using two isomeric cyclopropenes as chemical reporters was developed. ... mehrFirst, a small library of 1-methylcyclopropene-modified 2'-deoxynucleosides with different linker structures was synthesized and used in a bioorthogonal Diels-Alder reaction with inverse electron demand. This reaction was then carried out orthogonally to a photoclick reaction of 3-methylcyclopropene-modified 2'-deoxynucleosides with a tetrazole, thus providing a basis for the application of dual labeling in vitro. The corresponding cyclopropene-modified 2'-deoxynucleoside triphosphates were then synthesized and used in primer extension experiments. Both 1- and 3-methylcyclopropene-modified derivatives were accepted by the tested polymerases and enzymatically inserted into DNA. Subsequent post-synthetic labeling of the 1-methylcyclopropene-modified oligonucleotide by reaction with a cyanine-styryl-tetrazine conjugate was achieved within minutes. Finally, the fluorescent labeling of genomic DNA in HeLa cells was demonstrated via the two different bioorthogonal reactions after metabolic incorporation of the cyclopropene-modified substrates by the cellular enzymes. Finally, by combining all necessary intracellular transport and labeling steps, the dual bioorthogonal labeling of cellular DNA via orthogonal Diels-Alder reaction with inverse electron demand and photoclick reaction could be demonstrated for the first time. The protocol developed here represents a basis for the development of new labeling strategies, which in future may enable the investigation of interactions of nucleic acids at the molecular level in vivo.