Unravelling the Matrix - On the Interplay of Microenvironment and Cellular Mechanoresponse = Die Matrix entschlüsseln - über das Zusammenspiel von Mikroumgebung und zellulärer Mechanoantwort

Die Mikroumgebung beeinflusst maßgeblich zelluläre Prozesse wie Polarisation, Migration oder Embryonalentwicklung durch chemische und biophysikalische Reize. An der zellulären Mechanoantwort sind zahlreiche Komplexe beteiligt. Hierzu zählen Fokalkontakte oder das Aktomyosinnetzwerk, bestehend aus Aktinfasern sowie nicht-muskulärem Myosin II (NM II). Während der Einfluss von Substratsteifigkeit ausgiebig untersucht wurde, bleiben andere Materialeigenschaften biologischer Gewebe wie Auxetizität oder Viskoelastizität in vitro schwer nachzubilden. Die Modellierung solcher Aspekte stellt demnach bis heute eine Herausforderung dar.
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In dieser Arbeit wurde ein neuartiger Ansatz zum Einbringen von seltenen Materialeigenschaften untersucht. Dieser nutzt sogenannte Metamaterialien, welche durch das Anpassen von Materialeigenschaften mittels Mikrostrukturierung gebildet werden. Metamaterialien mit unterschiedlichen Poissonzahlen oder Elastizitätsmoduli wurden als Kultursubstrate für Lebendzellmikroskopie verwendet. Zelluläre Kräfte wurden aus diesen Zeitreihen mit bisher unerreichter räumlich-zeitlicher Auflösung bestimmt. Der Vergleich von mesenchymalen Stammzellen mit Fibroblasten ergab eine unterschiedliche Sensitivität für Metamaterialien. Diese entsteht durch die kontraktilitätsabhängige Wahrnehmung der Substratsteifigkeit, wie vom "molecular clutch model" postuliert.
Im zweiten Teil dieser Thesis wurde der Einfluss von Substratmikrostrukturierung auf Zellmorphologie und -polarisation untersucht. Hierfür wurden ausgerichtete und zufällig verteilte Gelatine-Nanofasern mittels Elektrospinnen hergestellt. Um die umstrittene Rolle von Kontraktilität genauer zu bestimmen, wurden Zelllinien mit einem Knockout für NMIIA oder NMIIB auf diesen Substraten kultiviert. NMIIA wurde als Hauptregulator der morphologischen Adaptation identifiziert, während NMIIB vorwiegend dessen Aktivität reguliert. Der Einfluss auf die Zellpolarisation wurde anhand der Morphologie und Lokalisation des Golgi-Apparats bestimmt. Beide Knockouts führten zu einer veränderten Morphologie, beeinflussten die Lokalisation allerdings nur marginal. Demnach ist das Zusammenspiel beider NMII-Isoformen essentiell, um Kompaktion oder Verteilung des Golgi-Apparats zu unterbinden, jedoch ist dieses nicht notwendig, um Polarisation zu initiieren. In kommerziellen parallelen und orthogonalen 3D-Kollagenfasernetzwerken zeigten sich die Effekte des NMIIB Knockouts nur abgeschwächt, welches auf eine Kompensation durch die Fasernetzwerke hindeutet. Die Zellpolarisation beider Knockout-Zelllinien war durch die unterschiedlichen Faserausrichtungen stärker betroffen, während Wildtypzellen keine Reaktion zeigten. Diese Ergebnisse implizieren eine zentrale Rolle von NMIIA und NMIIB in der Polarisationsregulation in 2D- und 3D-Umgebungen, die über Kontraktilität hinaus geht.
Im letzten Abschnitt wird ein Experimentsetup beschrieben, welches zur Untersuchung des Übergangs von mesenchymaler zu amoeboider Migration unter steigender räumlicher Begrenzung mittels Lebendzellmikroskopie eingesetzt werden kann.

Zusammenfassend werden in dieser Thesis unterschiedliche Ansätze zur Untersuchung der zellulären Mechanoantwort auf verschiedene Aspekte der Mikroumgebung präsentiert. Diese beinhalten die Entwicklung einer neuartigen Metamaterial-basierten Analyse zellulärer Kraftfelder. Weiterhin wurde für NMII eine zusätzliche Rolle als Mediator der Golgi-Morphologie sowie in der Regulation der Sensitivität für die Organisation von 3D-Umgebungen bestimmt.

The microenvironment plays a crucial role in a multitude of different cellular processes such as polarisation, cell migration or embryonic development. As cells interact with their surroundings, they experience a variety of chemical or biophysical cues from the microenvironment. By now, numerous complexes involved in the mechanoresponse to the cellular microenvironment have been identified, including focal adhesions and the actomyosin network comprising actin fibres and non-muscle myosin II (NM II). On the microenvironmental side, substrate stiffness was broadly discussed in the past. ... mehrHowever, biological tissues exhibit a range of material properties such as auxetic behaviour or viscoelasticity, which are rare or hard to recreate in vitro. Thus, accurately replicating various aspects of the cellular microenvironment remains a challenge.

Within this work, a novel approach to access rare material properties was explored. For this, a new material class termed metamaterials was employed, which results from altering mechanical properties of materials by appropriate microstructuring. Metamaterials with different Poisson’s ratios and Young’s moduli served as cell culture substrates during live cell imaging. From these timeseries, cellular forces were determined with unprecedented spatiotemporal resolution. Comparison of mesenchymal stem cells and fibroblasts revealed a different sensitivity to metamaterials, rooted in contractility-dependent stiffness sensing postulated by the molecular clutch model.
In the second part of this thesis, the effect of substrate micropatterning on cell morphology and polarisation was analysed. For this, aligned and random gelatine nanofibres were fabricated by electrospinning. To determine the ambiguously reported role of contractility in more detail, cells possessing a knock-out of NMIIA or NMIIB were subjected to these nanofibre substrates. In agreement with the inherently different dynamic properties of these isoforms, NMIIA was identified as the main driver of morphological adaptation whereas NMIIB regulated NMIIA activity to prevent overshooting responses. The effect on polarisation was assessed by Golgi apparatus localisation and morphology. Either knock-out led to altered Golgi apparatus morphology but only marginally affected localisation. Thus, while being dispensable for initiating polarisation, the interplay of both isoforms is needed to prevent dispersion or compaction of the Golgi apparatus. Additionally, the same analysis was conducted within commercially available parallel and orthogonal 3D collagen fibres. Here, the morphological effects of NMIIB KO appeared dampened and thus were partially compensated by the collagen fibre arrangement. On the other hand, polarisation was more sensitive to fibre orientation for both knock-outs, while wt cells behaved the same on either fibre substrate. These results imply a central role of NMIIA and NMIIB in regulating polarisation in 2D and 3D which goes beyond facilitating contractility.
In the last section, an experimental setup is presented to study the transition from mesenchymal to amoeboid migration under increasing confinement during live cell imaging.

Together, this thesis explored different approaches to analyse the cellular mechanoresponse to different aspects of the microenvironment, including the development of a novel metamaterial-based analysis of cellular force fields. Further, beyond providing contractility, NMII was characterised as a mediator of Golgi apparatus morphology and sensitivity to 3D environment organisation.