Personalized Drug Response Profiling for Patient-Derived CLL cells via Miniaturized Gene Expression and Drug Sensitivity Testing on Droplet Microarray

Hochdurchsatztechnologien haben die moderne Forschung in den biologischen, biochemischen und chemischen Wissenschaften grundlegend verändert, indem sie ein schnelles Screening einer großen Anzahl von Verbindungen, Genen oder Zellen ermöglichen. Diese Fortschritte haben groß angelegte Experimente ermöglicht, die umfangreiche Datensätze generieren, die für das Verständnis komplexer biologischer Systeme und die Förderung der Arzneimittelentwicklung von entscheidender Bedeutung sind. Zu den wichtigsten Vorteilen dieser Hochdurchsatzmethoden gehören die Möglichkeit, Tausende von Proben gleichzeitig zu testen, die Automatisierung von Arbeitsabläufen und die Verringerung menschlicher Fehler. ... mehrDiese Vorteile gehen jedoch auch mit erheblichen Nachteilen einher, darunter die hohen Kosten für die erforderliche Ausrüstung, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien. Zudem sind für Hochdurchsatzexperimente oft beträchtliche Mengen an biologischem Material erforderlich, das sowohl knapp als auch schwer zu beschaffen sein kann. Die durch die Komplexität und das Volumen der generierten Daten verursachten Herausforderungen erfordern zudem den Einsatz hochentwickelter Analysetools und Rechenressourcen. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, hat sich die Miniaturisierung als wirkungsvolle Strategie erwiesen. Durch die Verkleinerung des Maßstabs von Reaktionen und Probenvolumina reduzieren miniaturisierte Plattformen die Reagenzienkosten erheblich und sparen wertvolles biologisches Material, wodurch Hochdurchsatzexperimente zugänglicher und effizienter werden. Die Skalierung auf kleinere Dimensionen erhöht auch den experimentellen Durchsatz, sodass eine größere Anzahl von Bedingungen gleichzeitig getestet werden kann, während die Gesamtkosten und der Ressourcenbedarf sinken. Die Integration der Miniaturisierung in Hochdurchsatzsysteme ist besonders wichtig für den Fortschritt der personalisierten Medizin, bei der schnelle und kostengünstige Tests unerlässlich sind, um vielversprechende therapeutische Kandidaten zu identifizieren, die auf die genetischen, molekularen und umweltbedingten Profile einzelner Patienten abgestimmt sind. Ein wichtiger Ansatz ist die personalisierte Medizin, bei der Therapien auf die spezifischen Eigenschaften jedes Patienten zugeschnitten werden. Dieser Ansatz ist besonders in der Onkologie von Bedeutung, da die Wirksamkeit der Behandlung zwischen Patienten mit derselben Krebsart stark variieren kann. Durch die Maximierung der therapeutischen Wirksamkeit bei gleichzeitiger Minimierung von Nebenwirkungen verspricht die personalisierte Medizin, die Behandlungsergebnisse zu verbessern. Die Verwirklichung der personalisierten Medizin erfordert jedoch robuste Hochdurchsatzwerkzeuge, die in der Lage sind, kleinste, patientenabgeleitete Proben zu verarbeiten und genaue, validierte Daten bereitzustellen.
Die Droplet Microarray (DMA)-Plattform stellt eine vielversprechende Lösung dar, die die Stärken von Hochdurchsatz-Screening, Miniaturisierung, Parallelisierung und Demultiplexierung in einem einzigen, vielseitigen System vereint. Es wurde gezeigt, dass diese Plattform Medikamentensensitivitäts- und Reaktionstests (Drug sensitivity and resistance testing = DSRT), medikamenteninduzierte Genexpressionsanalysen (DGEA) und andere wichtige Assays im Nanoliterbereich durchführen kann. Durch die erhebliche Reduzierung der Proben- und Reagenzienbedarf verbessert die DMA-Plattform die Effizienz und Kosteneffizienz von Hochdurchsatzexperimenten und unterstützt gleichzeitig die Entwicklung personalisierter Strategien für die klinische Anwendung in der Onkologie. Dieser kombinierte Ansatz hat das Potenzial, die funktionelle Präzisionsmedizin zu revolutionieren, indem genauere und individualisierte Behandlungspläne ermöglicht werden, die auf die spezifischen Bedürfnisse jedes Patienten abgestimmt sind.
Das erste Projekt stellt eine neuartige Methodik vor, bei der patientenabgeleitete chronisch lymphatische Leukämiezellen (CLL) in eine Hydrogelmatrix auf der DMA-Plattform integriert werden. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die erheblichen Herausforderungen bei der Kultivierung von CLL-Zellen zu bewältigen, die zu früher Apoptose neigen und unter konventionellen In-vitro-Bedingungen eine geringe Überlebensfähigkeit aufweisen. Typischerweise erfordern CLL-Zellen eine Co-Kultur mit unterstützenden Stromazellen oder das Vorhandensein löslicher Faktoren, um das Überleben zu fördern und die komplexe Tumormikroumgebung nachzuahmen. Erste Experimente in herkömmlichen Medien zeigten eine drastisch niedrige Zellviabilität, was die Einschränkungen traditioneller Kulturmethoden verdeutlicht. Durch die Integration der Hydrogelmatrix in die DMA-Plattform konnten wir die Viabilität von CLL-Zellen erheblich verbessern und nach 24 Stunden eine bemerkenswerte Überlebensrate von 68 % erreichen, eine signifikante Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden. Die Hydrogelmatrix bot nicht nur die notwendige strukturelle Unterstützung, sondern schuf auch eine stabile Umgebung, die das Überleben der Zellen über die Zeit hinweg förderte, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für das DSRT von patientenabgeleiteten CLL-Zellen macht.
Das zweite Projekt stellt eine neuartige miniaturisierte Methode für die medikamenteninduzierte differentielle Genexpressionsanalyse (DGEA) im Nanoliterbereich vor, ein wichtiges Instrument zur Aufdeckung der molekularen Grundlage zellulärer Veränderungen nach einer medikamentösen Behandlung. Diese Methode ist besonders wertvoll für die Hochdurchsatzanalyse von Krebszellen, die aus Patientenbiopsien stammen, da hier die Knappheit der Proben eine erhebliche Herausforderung darstellt. Mithilfe der DMA-Plattform ermöglicht dieser innovative Ansatz eine parallele Analyse der Arzneimittelreaktionen in patientenabgeleiteten Zellen und überwindet effektiv die Einschränkungen traditioneller Protokolle. Die Methode umfasst eine Reihe von Schritten, darunter Zelllyse zur Isolierung von mRNA, cDNA-Konversion und anschließende quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Analyse. Diese Arbeit demonstriert das Potenzial dieses Ansatzes für die funktionelle Präzisionsonkologie, indem sie Einblicke in die individuellen Tumorreaktionen auf Krebsmedikamente bietet.
Das dritte Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung und Optimierung eines Seq-on-a-Chip-Protokolls unter Verwendung der DMA-Plattform für die Hochdurchsatzanalyse des globalen Transkriptoms. Dieser Ansatz erhöht die Effizienz und Präzision der RNA-Sequenzierung durch die Miniaturisierung des Probenvorbereitungsprozesses und die Integration von barcodierten Oligo-dT-Primeren mit Unique Molecular Identifiers (UMIs). Die Studie zeigt, dass die DMA-Plattform vergleichbare und in einigen Aspekten sogar überlegene Leistungen gegenüber herkömmlichen PCR-Röhrchenmethoden erbringt, insbesondere bei der Erfassung und genauen Erfassung komplexer transkriptomischer Profile. Die Integration dieser Methode in die DMA-Plattform ermöglicht eine Reduzierung des Reagenzienverbrauchs und eine Steigerung des Durchsatzes, was insbesondere in Szenarien von Vorteil ist, in denen die Verfügbarkeit von Patientenproben begrenzt ist. Zusammengefasst demonstrieren diese Projekte das Potenzial der DMA-Plattform als umfassendes Werkzeug für DSRT, DGEA und globale Transkriptomanalysen. Es wird erwartet, dass die laufende Forschung und die kontinuierliche Verfeinerung dieser Methodologien die funktionelle Präzisionsonkologie transformieren werden, indem sie die Entwicklung präziser, personalisierter Behandlungsstrategien ermöglicht, die auf das Profil jedes einzelnen Patienten zugeschnitten sind.

High-throughput technology has changed the landscape of modern research in the biological, biochemical, and chemical sciences, enabling rapid screening of large numbers of compounds or genes with cells or proteins. These advances have enabled large-scale experiments generating large datasets critical to understanding complex biological systems and advancing drug discovery. The key benefits of these high-throughput methods are the ability to test thousands of samples simultaneously, the automation of workflows and the reduction of human error. However, these benefits also come with significant drawbacks, including the high cost of the equipment, consumables and reagents that are required. ... mehrIn addition, significant amounts of biological material, which can be both scarce and difficult to obtain, are often required for high-throughput experiments. The challenges posed by the complexity and volume of the data generated also require the use of sophisticated analytical tools and computational resources. To address these challenges, miniaturisation has emerged as a powerful strategy. By reducing the scale of reactions and the volume of samples, miniaturised platforms significantly reduce reagent costs while conserving valuable biological materials, making high-throughput experimentation more accessible and efficient. Scaling down also increases experimental throughput, allowing a greater number of conditions to be tested simultaneously, while reducing overall costs and resource requirements. The integration of miniaturisation into high-throughput systems is particularly important for the advancement of personalised medicine, where rapid and cost-effective testing is essential to identify promising therapeutic candidates tailored to the genetic, molecular and environmental profiles of individual patients. One important approach is Functional Precision Oncology, in which therapies are customised to the unique molecular and cellular characteristics of each patient’s cancer. It involves testing the response of individual patients-derived cells to different drugs or combinations of treatments, allowing for more personalized and effective therapeutic strategy. It is particularly important in oncology, where treatment efficacy can vary widely between patients with the same type of cancer, due to the heterogeneity of tumours and their different genetic and phenotypic profiles. By maximising therapeutic efficacy while minimising side effects, precision oncology promises to improve patient outcomes. However, the realisation of functional precision oncology requires robust, high-throughput screening tools capable of handling minute patient-derived samples and providing accurate, validated data.
The droplet microarray (DMA) platform is a promising solution that combines the strengths of high-throughput screening, miniaturisation, and parallelization in a single, versatile system. This platform has been shown in my work to perform drug sensitivity and response testing (DSRT), drug-induced gene expression analysis (DGEA) and other critical assays at the nanoliter scale. By significantly reducing sample and reagent requirements, the DMA platform improves the efficiency and cost-effectiveness of high-throughput experimentation while supporting the development of functional precision oncology strategies for clinical application. This combined approach has the potential to revolutionise functional precision oncology, enabling more accurate and individualised treatment plans tailored to the specific needs of each patient.
In my thesis, I focused on developing methods for functional precision oncology using a DMA chip on CLL (chronic lymphocytic leukemia) cells. I worked on optimizing workflows for cell culture conditions and enhancing the readout quality of information obtained after drug treatment. Since CLL cells, like most hematopoietic cells, do not proliferate in vitro and are prone to undergo spontaneous apoptosis in culture, overcoming these challenges was crucial.
In my first project, I focused on developing a novel methodology that integrates patient derived CLL cells into a hydrogel matrix on the DMA platform. This approach addresses the significant challenges associated with culturing CLL cells, which are prone to early apoptosis and exhibit poor viability under conventional in vitro conditions. Typically, CLL cells require co-culture with supportive stromal cells or the presence of soluble factors to enhance survival, mimicking the complex tumour microenvironment. Initial experiments in conventional media showed drastically low cell viability of CLL cells on DMA chip, highlighting the limitations of traditional culture methods. By incorporating a hydrogel matrix into the DMA platform, we were able to significantly improve CLL cell viability, achieving a remarkable 68% viability at 24 hours, a significant improvement over conventional method. The hydrogel matrix not only provided essential structural support, but also created a stable environment that enhanced cell survival over time, making it a valuable tool for DSRT of patient-derived CLL cells.
The second project introduces a novel miniaturised method for drug-induced differential gene expression analysis (DGEA) at the nanolitre scale, a critical tool for uncovering the molecular basis of cellular changes following drug treatment. This method is particularly valuable for high-throughput analysis of cancer cells derived from patient biopsies, where sample scarcity is a significant challenge. Using the DMA platform, this innovative approach enables parallel analysis of drug responses in patient-derived cells, effectively overcoming the limitations of traditional protocols. The method involves a series of steps including cell lysis for mRNA isolation, cDNA conversion and subsequent quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. This work demonstrates the potential of this approach for functional precision oncology, providing insights into individual tumour responses to cancer drugs. As a next step, I focused on the development and optimisation of the Seq-on-a-Chip protocol by introducing barcodes on the DMA platform for high-throughput global transcriptome analysis. This approach increases the efficiency and precision of RNA sequencing by miniaturising the sample preparation process and integrating barcoded oligo-dT primers with Unique Molecular Identifiers (UMIs). The integration of this method into the DMA platform allows for a reduction in reagent consumption and an increase in throughput, which is particularly beneficial in scenarios where patient sample availability is limited. Taken together, this project demonstrates the potential of the DMA platform as a comprehensive tool for DSRT, DGEA and global transcriptome analysis. Ongoing research and continued refinement of these methodologies is expected to transform functional precision oncology by enabling the development of precise, personalised treatment strategies unique to each patient's profile. Additionally, DGEA will provide deep, valuable understanding of the underlying mechanisms of drug response and reveal variations in how different patients respond to treatment. It will also highlight the mechanisms involved in drug resistance, enabling more accurate strategies for predicting patient-specific responses to therapies and ultimately improving clinical outcomes.