Abstract:
Die Zahl der Krebserkrankungen ist stetig steigend und die Prognose insbesondere für Glioblastompatienten trotz aller Fortschritte weiterhin schlecht. Gehirntumoren sind nicht nur häufig inoperabel, sondern auch unzureichend zu therapieren, da Chemotherapeutika die Blut-Hirn-Schranke nicht effektiv überwinden können. Liposomen als kugelförmige Trägersysteme aus Phospholipiden, bieten eine Möglichkeit, Wirkstoffe zielgerichtet und effizient zu transportieren. Moderne Technologien erlauben die Herstellung asymmetrischer Liposomen auf Basis von zwei inversen Perfluorocarbon (PFC)-Nanoemulsionen. ... mehrDer unterschiedliche Aufbau der Phospholipidschichten eines asymmetrischen Liposoms ermöglicht es einerseits Wirkstoffe vor einem schnellen Abbau zu schützen, aber auch andererseits durch vielseitige Oberflächenmodifikation gezielt an den Wirkort zu bringen.
Die druckabhängige Homogenisierung von Perfluorocarbon-in-Wasser (PFC/W) Nanemulsionen zeigt bei der Untersuchung der Strömung von gemischten Suspensi-onen aus Liposomen und Emulsionströpfchen (PFC-Tröpfchen) zwei Übergänge von laminarer Strömung zu Turbulenz in unterschiedlichen Kanalabschnitten. Diese wurden durch Berechnung der Reynolds-Zahlen in den Interaktionskammern identifiziert. Der erste Übergang tritt zwischen 750 bar und 1.000 bar auf, der zweite zwischen 1.500 bar und 1.750 bar. Nur der erste Turbulenzumschlag beeinflusst die Tröpfchengröße signifikant, aufgrund der hoher Scherrate. Die Ergebnisse zeigen, dass die Partikelgröße bei laminarer Strömung stärker abnimmt, was auf unterschied-liche Partikelverteilungen in rechteckigen Kanalquerschnitten zurückzuführen ist. Bei laminarer Strömung konzentrieren sich die Partikel in der Mitte, während sie bei turbulenter Strömung in den Ecken und Diagonalen des Kanals konzentriert sind. Nur Liposomen können über den gesamten Druckbereich von 250 bar bis 2.000 bar in kleinere Partikel zerlegt werden, während die PFC-Tropfengröße nur bei ≤ 750 bar verringert werden kann.
Untersuchungen zur Zyklenzahl zeigen, dass ein Tropfenaufbrechen nur bei den ersten 15 Zyklen stattfindet. Bei 25 Zyklen nimmt die Tröpfchengröße aufgrund hoher Rekoaleszenzrate zu, da die Partikel zur Verschmelzung neigen. Das Aufbrechen der liposomalen Doppelschichten in emulgierende Monoschichten erfolgt mit einer konstanten Rate von 5 Zyklen bis 25 Zyklen.
Die Formulierungsparameter beeinflussen die Emulgierung ebenfalls stark. So zeigt sich mit steigendem Cholesterolgehalt in der Emulgatorzusammensetzung eine steigende Partikelgröße. Das Optimum der Emulgatorkonzentration liegt bei 5 mM, was ein ideales Verhältnis der Lipidkonzentration zum Volumen der dispersen Phase von 2 mM / 1 % (v/v) ergibt. Nur dann bilden die Emulgatormoleküle eine Mono-schicht um den PFC-Tropfen. Höhere Verhältnisse führen zu inhomogenen Verteilungen oder Multischichten der Phospholipide. Ein größeres dispergiertes Volumen erhöht die Partikelgröße, ohne die Verteilung zu beeinflussen. DPPC ist Emulgator aufgrund seiner resultierenden kleinen Emulsionströpfchen zu bevorzu-gen. Ein höheres Zeta Potential sowie eine höhere molekulare Oberfläche der Phospholipide in Bischichten verringern die Partikelgröße und erhöhen die relative Partikelanzahl. Zwitterionische Phospholipide sind weniger effizient als anionische hinsichtlich des Aufschlusses von Liposomen zu emulgierenden Monoschichten. Das Viskositätsverhältnis der dispersen zur kontinuierlichen Phase beeinflusst die Partikelgröße, deren Verteilung und den Anteil verbleibender Liposomen maßgeb-lich. Diese Korrelation gilt jedoch nur für die Variation des Viskositätsverhältnisses mit Hilfe von zyklischen Perfluorocarbonen. Ein möglichst niedriges Verhältnis der Viskositäten beider Phasen ist zu bevorzugen.
Bei der Herstellung asymmetrischer Liposomen bildet die PFC/W Nanoemulsion die äußere Phospholipidschicht, welche für einen zielgerichteten Transport modifiziert werden kann. Eine Modifikation mit Glucose erhöht die zelluläre Aufnahme der Liposomen, insbesondere bei den humanen Glioblastomzellen U-87 MG, trotz niedrigerer GLUT1-
Expression verglichen zu den murine zerebralen Endothelzellen bEnd.3. Diese reagieren sensitiver als Glioblastomzellen auf einen Glucoseentzug, indem sie die Expression des GLUT1 steigern. Ursache für die geringere Sensitivität der Gliobla-tomzellen auf den Glucoseenzug ist deren Nutzung alternativer Energiequellen wie beispielsweise Lactat.
Murine bEnd.3 Zellen differenzieren die zelluläre Aufnahme von Liposomen basierend auf deren Oberflächenmodifikationen, während dies U-87 MG Zellen nicht auftritt. Die Geschwindigkeit der Liposomenaufnahme ist bei bEnd.3 bei hohen Lipidkonzentration, stark variierend während U-87 MG Zellen lediglich bei niedrigen und mittleren Konzentrationen Unterschiede zeigen. Eine Modifikation mit Succinimid erhöht die zelluläre Aufnahme vermutlich durch Rezeptor-vermittelte Mechanismen, insbesondere bei bEnd.3 Zellen.
Eine Modifikation der liposomalen Oberfläche mit Apolipoprotein E3 (ApoE3) steigert die zelluläre Aufnahme über den Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) Rezeptor bei murinen bEnd.3 Zellen und humanen U-87 MG Zellen, hingegen weniger bei F98 Zellen Vergleichende Untersuchungen zeigen, dass ApoE3-modifizierte Liposomen ähnliche Sättigungswerte bei U-87 MG und F98 Zellen erreichen, trotz unterschiedlicher LRP1-Expression und Aufnahmeraten. Eine c(RGD)-Modifikation der Liposomen verbessert insbesondere bei Endothelzellen die zelluläre Aufnahme, welche über den Integrin αV-Rezeptor vermittelt wird. Bei den Tumorzellen zeigen U-87 MG Zellen eine trotz steigender Lipidkonzentration oder Steigerung der Inkubationszeit gleichbleibende zelluläre Aufnahmen. Die F98 Zellen hingegen zeigen eine deutlich geringere liposomale Internalisierung, welche sowohl konzentrations- als auch zeitabhängig steigend ist.
Doch nicht nur die Modifikation der liposomalen Oberfläche für eine zielgerichtete Therapie ist von großer Bedeutung, auch deren Hydrophilisierung zur Abschirmung des Trägersystems im Blutsystem ist von hoher Relevanz. Die Präparation gerin-nungshemmender Heparin-Fragmente, deren kovalente Bindung an verschiedene liposomale Anker, sowie deren Hämokompatibilität mit menschlichem Vollblut konnte erfolgreich gezeigt werden. Die Heparinisierung der liposomalen Oberfläche ist eine denkbare Alternative für den derzeitigen Standard Polyethylenglycol (PEG).
Erste Versuche zur emulsionsbasierten Herstellung asymmetrischer Liposomen zeigten vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich der Partikelgröße, Lagerungssta-bilität sowie der Einkapselungseffizienz. Sie bieten ein enormes Potential als Plattform eines liposomalen Trägersystems für eine zielgerichtete Therapie und die Verkapselung von Wirkstoffen speziell angepasst an verschiedene Arten von Tumoren.
Abstract (englisch):
The number of cancer cases is constantly rising and the prognosis for glioblastoma patients in particular remains poor despite all the progress made. Brain tumors are not only often inoperable but also inadequately treatable, as chemotherapeutics cannot effectively cross the blood-brain barrier. Liposomes, as spherical carrier systems made of phospholipids, offer a way of transporting active substances in a targeted and efficient manner. Current developments aim to achieve the production of asymmetric liposomes based on two inverse perfluorocarbon (PFC) nanoemulsions. The different structure of the phospholipid layers of an asymmetric liposome makes it possible, on the one hand, to protect active ingredients from rapid degradation and, on the other hand, to deliver them specifically to the site of action through versatile surface modification.
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The pressure-dependent homogenization of perfluorocarbon-in-water (PFC/W) nanoemulsions shows two transitions from laminar flow to turbulence when investigating the flow of mixed suspensions of liposomes and emulsion droplets (PFC droplets). These were identified by calculating the Reynolds numbers in the interaction chambers. The first transition occurs between 750 bar and 1,000 bar, the second between 1,500 bar and 1,750 bar. Only the first turbulence transition influences the droplet size significantly, due to the high shear rate. The results show that the particle size decreases more with laminar flow, which is due to different particle distributions in rectangular channel cross-sections. In laminar flow, the particles are concentrated in a rectangular ring around the center in a high shear zone, while in turbulent flow they are concentrated in the corners and diagonals of the channel in low shear zones. Only liposomes can be broken down into smaller particles over the entire pressure range from 250 bar to 2,000 bar, while the PFC droplet size can only be reduced at ≤ 750 bar.
Investigations on the number of cycles show that droplet break-up only occurs for the first 15 cycles. At 25 cycles, the droplet size increases due to the high rate of recoalescence, as the particles tend to merge. The break-up of the liposomal bilayers into emulsifying monolayers occurs at a constant rate from 5 cycles to 25 cycles.
The formulation parameters also have a strong influence on emulsification. For example, as the cholesterol content in the emulsifier lipid composition increases, the particle size increases. The optimum emulsifier concentration is 5 mM, which results in an ideal ratio of the lipid concentration to volume of the dispersed phase of 2 mM / 1 % (v/v). In this case, the emulsifier molecules form a monolayer around the PFC droplet. Higher ratios lead to inhomogeneous distributions or multilayers of phospho-lipids. A larger dispersed volume increases the particle size without affecting the size distribution. The length of the fatty acid chain of the phospholipid should be selected on the basis of the phase transition temperature given possible recoalescence of the droplets or inefficient vesicle disruption. A higher Zeta potential as well as a higher molecular surface area of the phospholipids in a bilayer reduce the particle size and increase the relative number of particles. Zwitterionic phospholipids are less efficient than anionic phospholipids in breaking down liposomes into emulsifying monolayers. The viscosity ratio of the dispersed to the continuous phase significantly influences the particle size, their distribution and the proportion of remaining liposomes. However, this correlation only applies to the variation of the viscosity ratio with the aid of cyclic perfluorocarbons. The lowest possible ratio of the viscosities of the two phases is preferable.
The PFC/W nanoemulsion forms the outer phospholipid layer in the production of asymmetric liposomes, which can be modified for targeted transport. Modification with glucose increases the cellular uptake of liposomes, especially in human glioblastoma cells
U-87 MG, despite lower expression of the glucose transporter 1 (GLUT1) compared to murine cerebral endothelial cells bEnd.3, which respond more sensitively than glioblastoma cells to glucose deprivation by increasing GLUT1 expression. The reason for the lower sensitivity of glioblastoma cells to glucose deprivation is their ability to use alternative energy sources such as lactate.
Murine bEnd.3 cells differentiate the cellular uptake of liposomes based on their surface modifications, whereas U-87 MG cells do not. The rate of the liposomal uptake is highly variable in bEnd.3 at high lipid concentrations, whereas U-87 MG cells only show differences at low and medium concentrations. Modification with succinimide increases cellular uptake presumably by receptor-mediated mecha-nisms, especially in bEnd.3 cells.
Modification of the liposomal surface with apolipoprotein E3 (ApoE3) increases cellular uptake via the low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1) in murine bEnd.3 cells and human U-87 MG cells, but less so in F98 cells Comparative studies show that ApoE3-modified liposomes achieve similar saturation levels in U-87 MG and F98 cells, despite different LRP1 expression and uptake rates. A c(RGD)-modification of liposomes improves cellular uptake, particularly in endothelial cells, which is mediated via the integrin αVβ3 receptor. In tumor cells, U-87 MG cells show consistent cellular uptake despite increasing lipid concentration or increasing incubation time. In contrast, the F98 cells show a significantly lower liposomal internalization compared to U-87 MG cells, which is in a concentration- and time-dependent increasing manner.
However, not only the modification of the liposomal surface for a targeted therapy is of great importance, but also its hydrophilization for shielding the carrier system in the blood system is of high relevance. The preparation of anticoagulant heparin fragments and their covalent binding to various liposomal anchors has been successfully demonstrated as well as their hemocompatibility with human whole blood. Heparinization of the liposomal surface is a conceivable alternative to the current standard polyethylene glycol (PEG).
Initial investigations on the emulsion-based production of asymmetric liposomes showed promising results in terms of particle size, storage stability and encapsulation efficiency. They offer enormous potential as a platform for a liposomal drug delivery system for targeted therapy and encapsulation of active ingredients specifically adapted to different types of tumors.
