Strategien zur in vitro Rekonstitution topographischer axonaler Lenkung retinaler Axone und zur bildgebenden Darstellung ihrer molekularen Mechanismen

Die Aufklärung der Mechanismen neuronaler Verdrahtung während der Embryonalentwicklung gehört zu den zentralen Fragestellungen der Neurobiologie. Eines der wichtigsten Modelle der Entwicklung neuronaler Verschaltung sind topographische, also nachbarschaftstreue Projektionen. Die retinotektale Projektion retinaler Ganglienzellen (RGC) der Netzhaut (Retina) auf die optischen Zentren im Mittelhirn (Colliculi Superiores bzw. optisches Tektum) ist hierbei eines der am besten untersuchten Systeme. Vermittelt wird die retinotektale Projektion entlang der rostrocaudalen Achse nach bisherigem Wissensstand durch symmetrische, gegenläufige, repulsive Gradienten von EphA-Rezeptortyrosinkinasen und ephrin-A-Liganden entlang der respektiven Achsen von Retina und Tektum. Trotz jahrzehntelanger Untersuchungen sind die genauen Mechanismen der axonalen Lenkung jedoch weiterhin unvollständig verstanden. Wir vermuten, dass diese Gegengradienten ein Lenkungspotential an die Wachstumskegel vermitteln und das Zielgebiet im optischen Tektum durch die Wahrnehmung eines individuellen Potentialminimums erreicht wird.
Ziel dieser Arbeit war es, geeignete Werkzeuge für die Rekonstitution und Untersuchung einer topographisch kontinuierlichen Projektion auf Gegengradienten-Substraten in vitro zu entwickeln. ... mehrDurch eine Senkung des pH-Wertes konnte die starke Bindungsaffinität zwischen EphA3-hFc und ephrin-A2-mFc signifikant und reversibel herabgesetzt werden. Dies ermöglichte die erfolgreiche zweifache Funktionalisierung einer epoxysilanisierten Glas-Oberfläche durch micro contact printing von EphA3-hFc und Überschichtung mit ephrin-A2-mFc aus saurer Lösung ohne die gegenseitige Bindung und Inaktivierung der Lenkungsmoleküle. Hierbei stellte sich jedoch schon in Einzel- als auch alternierenden Doppelstreifen-Assays heraus, dass EphA3-hFc auf den für die geplanten Gradientenassays nötigen epoxysilanisierten oder zusätzlich mit Poly-L-Lysin und einem chemischen Crosslinker beschichteten Oberflächen nur sehr schwach gradiertes, aber nie topographisch differentielles reverse signaling auslöst. Ephrin-A2-mFc dagegen vermittelt selbst nach einer Rückführung in einen neutralen pH-Wert auf beiden Oberflächen sowohl ein gradiertes als auch topographisch differentielles forward signaling an retinale Axone, welches zudem eine teilweise bifunktionelle Rolle (Attraktion bei kleinen Konzentrationen) von ephrin-A2-mFc andeutet. Dies legt nahe, dass die erwartete Rolle des EphA3-Gradienten in derzeitigen in vitro Assays nicht adäquat abgebildet werden kann und dass das zugrunde liegende Modell der retinotektalen Projektion eventuell zu vereinfachte Annahmen über die Mechanismen der retinotektalen Projektion macht und weiterer Feinjustierung bedarf.
Des Weiteren konnte die Co-Expression von HaloTag-EphA3 und SNAP-ephrin-A5 in transfizierten RGC etabliert werden. Diese selbstmarkierenden Fusionsproteine erlauben, eventuell in Kombination mit Expansionsmikroskopie, die Visualisierung und Untersuchung der subzellulären Lokalisation und Dynamiken beider Lenkungsmoleküle in Wachstumskegeln während der axonalen Lenkung. Damit können die komplexen subzellulären Dynamiken während der topographischen Lenkung untersucht und weitere Erkenntnisse über die Mechanismen der retinotektalen Projektion erlangt werden.