Synthese und Charakterisierung von neuartigen Spirohexen-modifizierten Nukleosiden für die Markierung von DNA mittels bioorthogonaler Reaktionen

Die gezielte chemische Modifikation von Nukleinsäuren eröffnet neue Möglichkeiten zur spezifischen Visualisierung biologischer Prozesse. Besonders bioorthogonale Reaktionen, wie die Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (iEDDA) oder Photoclick-Reaktionen, haben sich als leistungsfähige Werkzeuge in der chemischen Biologie etabliert. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung neuartiger, chemisch modifizierter Nukleoside und Peptidnukleinsäuren zur dynamischen Visualisierung zellulärer Prozesse in vitro und in vivo.
Im ersten Teil der Arbeit werden Spirohexen-modifizierte Nukleoside und Oligonukleotide synthetisiert und hinsichtlich ihrer Reaktivität in iEDDA- sowie Photoclick-Reaktionen untersucht. ... mehrDabei liegt der Fokus auf dem Einfluss der Nukleobasen und der Linkerstruktur auf die Reaktionskinetik und die Fluoreszenzintensität. Spirohexene bieten aufgrund ihrer hohen Ringspannung und chemischen Stabilität ein bislang unerforschtes Potenzial als Reportergruppe in Oligonukleotiden und eignen sich durch ihre duale Funktionalität sowohl für iEDDA- als auch Photoclick-Markierungen.
Der zweite Teil der Arbeit widmet sich der Synthese von verschieden modifizierten acpcPNA-Sonden, welche mit den Fluorophoren Cy3 oder Atto647N markiert werden. Ziel ist es, mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) die Hybridisierung mit der sonic hedgehog-mRNA in Zebrafisch-Embryonen sichtbar zu machen. Durch die hohe Stabilität der PNA/RNA- und PNA/DNA-Duplexe im Vergleich zu natürlichen Nukleinsäuren wird eine effizientere Hybridisierung und ein stärkerer FRET-Effekt erwartet, was die Sensitivität der Fluoreszenzsignale in vivo verbessert.

The precise chemical modification of nucleic acids enables novel strategies for the selective visualization of biological processes. In recent years, bioorthogonal reactions such as the inverse electron-demand Diels–Alder (iEDDA) reaction and photoclick reactions have emerged as powerful tools in chemical biology. This dissertation focuses on the development and application of chemically modified nucleosides and peptide nucleic acids for the dynamic visualization of cellular processes in vitro and in vivo.
In the first part of this work, spirohexene-modified nucleosides and oligonucleotides are synthesized and systematically investigated with respect to their reactivity in iEDDA and photoclick reactions. ... mehrParticular attention is given to the influence of the nucleobase and linker structure on the reaction kinetics and fluorescence enhancement. Due to their high ring strain and chemical stability, spirohexenes represent an underexplored class of reporter groups for oligonucleotides. Their dual reactivity makes them suitable for both iEDDA and photoclick labeling.
The second part of the dissertation focuses on the synthesis of various modified acpcPNA probes, which are post-synthetically labeled with the fluorophores Cy3 or Atto647N. The aim is to visualize hybridization to sonic hedgehog mRNA in zebrafish embryos via Förster resonance energy transfer (FRET). Compared to natural nucleic acids, the higher stability of PNA/RNA and PNA/DNA duplexes is expected to enable more efficient hybridization and an enhanced FRET signal, thereby improving the sensitivity of fluorescence detection in vivo.