Der Einfluss von Dosis und Zeit auf die Vorhersage von Wirkmechanismen von Chemikalien durch Omics-Analysen

Diese Arbeit entstand im Rahmen des EU-Forschungsprojekts PrecisionTox und widmet sich der systematischen Untersuchung der Dosis- und Zeitabhängigkeit toxikologischer Effekte in zellbasierten Modellen. Ziel war es, die Wechselwirkungen von Dosis und Expositionsdauer getrennt zu analysieren, um spezifische von unspezifischen Zellantworten zu unterscheiden und frühe molekulare Marker toxischer Wirkungen zu identifizieren. In diesem Kontext wurden experimentelle Analysen unter anderem mit Omics-Methoden (Micro-Array, RNASequenzierung, Metabolomik) mit der Reanalyse öffentlich zugänglicher Daten kombiniert.
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Drei Untersuchungsschwerpunkte bilden den Kern der Arbeit: In einem ersten Teil wurden frühe molekulare Veränderungen bei Chemikalienexposition mit steatotischen Chemikalien in primären humanen Leberzellen analysiert. Die Reanalyse bestehender Micro-Array- und Metabolomdaten zeigte, dass Steatose-assoziierte Signalwege wie Fettsäuremetabolismus, Cholesterinstoffwechsel, ER-Stress und Entzündung bereits bei niedrigen Dosen und kurzen Expositionszeiten signifikant verändert sind. Durch die gezielte Variation der Kontrollgruppen durch Pooling unbehandelter und mit nicht-steatotische Chemikalien behandelter Zellen konnte die Trennschärfe und Sensibilität der Analysen gesteigert werden. Die identifizierten Signalwegmuster wurden erfolgreich mit bestehenden Adverse Outcome Pathways verknüpft und liefern neue Impulse für deren Weiterentwicklung.
Im zweiten Modul wurde im Rahmen einer Pilotstudie untersucht, ob spezifische toxikologische Effekte von allgemeinen Stressantworten unter subtoxischen Bedingungen abgegrenzt werden können. Dazu wurden Referenzsubstanzen bekannter Wirkung wie Cadmium, aber auch das Lösungsmittel DMSO bei unterschiedlichen Dosis-ZeitKombinationen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass für bestimmte Substanzen wie Natriumarsenit spezifische Reaktionsmuster bereits bei niedriger Dosis und früher Exposition erkennbar sind, während andere wie Ethoprophos erst zu späteren Zeitpunkten wirken. Auch zeigte sich, dass 3′-RNA-Sequenzierung grundsätzlich geeignet ist, um zentrale Signalwege zu detektieren, jedoch bei subtilen Effekten limitiert ist. Die kombinierte Auswertung transkriptomischer und metabolomischer Daten erwies sich als hilfreicher Ansatz, bedarf jedoch einer kontextsensitiven Interpretation.
Im dritten Teil wurde die bislang wenig untersuchte Substanzklasse der Imidazole analysiert.
Transkriptom- und Proteindaten der humanen Hepatozyten HepG2-Zelllinie zeigten einev dosisabhängige Deregulierung von Lipid-, Sterol- und Redoxstoffwechselwegen sowie eines autophagie-assoziierten Phänotyps. Ein potentiell ebenfalls autophagie-assoziierter Phänotyp wurde in der immortalisierten Lungenepithelzelllinie Beas-2B festgestellt. Die getesteten Verbindungen unterscheiden sich in Zellproliferations- und Zelltodeffekten sowie in Bezug auf LC3B-Akkumulation, p62-Anreicherung oder Vakuolenbildung. Trotz struktureller Ähnlichkeit, ist die Methylierung und Stereochemie zu beachten, da sie wahrscheinlich zu den Wirkungsunterschieden beiträgt. Hinsichtlich reprotoxischer, endokrin disruptiver und karzinogener Effekte sind vor allem erstere in diesen frühen Daten zu beobachten, wobei signifikante Regulationen in Redoxstoffwechsel und Suppression von Tumorsuppressorgenen
vorliegt.
Die Ergebnisse aller Module verdeutlichen die hohe Bedeutung einer differenzierten
Betrachtung von Dosis, Zeit und Expositionskontext in der Toxikologie. Es sind dynamische Prozesse und zeitlich gestaffelte Wirkmechanismen zu berücksichtigen und die Wahl der Analysemethodik und Grenzwerte. Die in dieser Arbeit verfolgte Methodenkombination – von Zellkultur über Sequenzierung bis zur Metabolomik – bietet einen praxistauglichen Zugang zur Hypothesengenerierung, -testung und potentiellen Identifikation früher, spezifischer Marker.
Die gezielte Nutzung und Reanalyse bestehender Datensätze leistet darüber hinaus einen Beitrag zur Reduktion von Tierversuchen im Sinne des 3R-Prinzips.

This work was carried out as part of the EU research project PrecisionTox and is dedicated to the systematic investigation of the dose and time dependence of toxicological effects in cellbased models. The aim was to analyze the interactions of dose and exposure duration separately in order to distinguish specific from non-specific cell responses and to identify early molecular markers of toxic effects. In this context, experimental analyses, including omics methods (microarray, RNA sequencing, metabolomics), were combined with the reanalysis of publicly available data.
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Three main areas of investigation form the core of the work: In first part, early molecular
changes chemical exposures with known steatotic compounds in primary human liver cells were analyzed. The reanalysis of existing microarray and metabolomic data showed that steatosisassociated signaling pathways such as fatty acid and cholesterol metabolism, ER stress and inflammation are significantly altered even at low doses and short exposure times. The selective variation of the control groups by pooling untreated cells and cells treated with non-steatotic compounds increased the discriminatory power and sensitivity of the analyses. The identified signaling pathway patterns were successfully linked to existing adverse outcome pathways and provide new impulses for their further development.
In the second module, a pilot study was conducted to investigate whether specific toxicological effects can be distinguished from general stress responses under sub-toxic conditions. For this purpose, reference substances with known effects such as cadmium as well as the solvent DMSO were analysed at different dose-time combinations. The results show that for certain substances such as sodium arsenic, specific reaction patterns are already recognizable at low doses and early exposure, while others such as ethoprophos only take effect at later points in time. It was also shown that 3'-RNA sequencing is generally suitable for detecting central signaling pathways, but is limited for subtle effects. The combined analysis of transcriptomic and metabolomic data proved to be a helpful approach, but requires a context-sensitive interpretation.
In the third part, the previously little-studied substance class of imidazoles was analysed.
Transcriptome data and protein analytics of the human hepatocyte HepG2 cell line showed a dose-dependent deregulation of lipid, sterol and redox metabolic pathways as well as
uncovering an autophagy-associated phenotype. A potential autophagy-associated phenotypevii was also observed in the immortalized lung epithelial cell line Beas-2B. The tested substances differ in their effects on cell proliferation and cell death, as well as LC3B accumulation, p62 enrichment and vacuole formation. Despite sharing a base structure, the methylation and stereochemistry is to be considered a possible source of the significant differences. Within this early data toxic effects on reproduction as well as processes possibly linking to endocrine disruption where identified with regulation affecting redox homeostasis and suppression of tumorsupressor genes hinting to the carcinogenic effects of imidazole compounds.
The results of all modules illustrate the great importance of a differentiated consideration of dose, time and exposure context in toxicology. Dynamic processes and temporally staggered mechanisms of action must be considered as well as the choice of analysis pipeline and cutoffs. The combination of methods pursued in this work - from cell culture and sequencing to metabolomics - offers a practical approach to hypothesis generation, testing and potential identification of early, specific markers. The targeted use and reanalysis of existing data sets also contributes to the reduction of animal testing in line with the 3Rs principle.