Abstract:
Phytochrome sind rotlichtgesteuerte Rezeptoren, welche ursprünglich in Pflanzen gefunden wurden. Mit der Möglichkeit der Genomsequenzierung wurden diese „Pflanzen“-Proteine immer häufiger auch in anderen Organismen wie dem Bodenbakterium Agrobacterium fabrum entdeckt. Anfangs wurde mit Hilfe dieser Bacteriophytochrome vor allem die Biochemie der Phytochrome untersucht, da physiologische/morphologische Effekte in Bakterien schwieriger zu erkennen sind als in Pflanzen. Nach und nach gelang es verschiedenen Gruppen, diese Effekte zu visualisieren, und es wurden für die Phytochrome von Agrobacterium fabrum Einflüsse auf das Wachstum, die Motilität, die bakterielle Konjugation und die Infektion von Pflanzen beobachtet. ... mehrLetztere gehören zu den Mechanismen des horizontalen Gentransfers und weisen eine gewisse strukturelle Ähnlichkeit zueinander auf. Bei der Konjugation wird ein gesamtes Plasmid über eine Relaxase genickt, kovalent gebunden und über einen Torwächter, dem Typ-IV-Coupling-Protein durch das Typ-IV-Sekretionssystem in die benachbarte Bakterienzelle übertragen, in dem es wieder re-zirkularisiert wird. Bei der Infektion läuft der Anfang identisch ab, nur, dass nicht ein gesamtes Plasmid, sondern nur ein kleiner Bereich, die sogenannte T-DNA, auf eine benachbarte Pflanzenzelle übertragen wird. Diese wird dann in den Zellkern transportiert und wird ins Pflanzengenom eingebaut.
Da beide Mechanismen durch Phytochrome beeinflusst werden und frühere Microarray-Ansätze keinerlei genetische Regulation der beteiligten Komponenten zeigten, wurde die Hypothese einer Protein-Protein-Interaktion als regulativer Mechanismus in den Mittelpunkt gestellt. Diese Arbeit befasst sich daher mit der Frage, ob eine Protein-Protein-Interaktion in vitro nachgewiesen werden kann oder nicht. Dazu wurden alle Relaxasen (TraATi, TraAAt, TraALC und VirD2) von Agrobacterium fabrum C58 gereinigt, charakterisiert und für Interaktionsversuche mit den Phytochromen Agp1 und Agp2 eingesetzt.
Es konnte gezeigt werden, dass die TraA’s alle die gleiche Nick-Stelle auf dem Ti-Plasmid erkennen, nicken und kovalent binden, obwohl nur TraATi selbst darauf lokalisiert ist. Ebenso konnte ein Einfluss auf die Aktivität des Fragments TraATi-mob durch Phytochrome detektiert werden. In weiteren Interaktionsexperimenten zeigte sich insbesondere, dass eine Interaktion zwischen vor allem Agp1 und TraATi sehr wahrscheinlich ist. Jedoch sind auch einige Indizien für die Interaktion mit Agp2 und TraATi gefunden worden. Die Interaktionen mit VirD2 hingegen zeigten weniger deutliche Signale. Ungeachtet dessen unterstützt diese Arbeit die Hypothese, dass eine Protein-Protein-Interaktion als potentieller Regulationsmechanismus für die horizontalen Gentransfermechanismen und insbesondere die Konjugation wahrscheinlich ist.
Abstract (englisch):
Phytochromes are red-light-regulated receptors that were originally identified in plants. With the advent of genome sequencing, these supposedly plant-specific proteins were increasingly found in other organisms as well, including the soil bacterium Agrobacterium fabrum. Initially, bacteriophytochromes were primarily used to study the biochemistry of phytochromes, as physiological or morphological effects are more difficult to detect in bacteria than in plants. Over time, however, various research groups succeeded in visualizing such effects in bacterial systems. For the phytochromes of Agrobacterium fabrum, effects on growth, motility, bacterial conjugation, and plant infection have been observed. ... mehrThe latter two processes — conjugation and infection — are mechanisms of horizontal gene transfer and share structural similarities. In conjugation, an entire plasmid is nicked at a specific site by a relaxase, covalently bound, and transferred to a neighbouring bacterial cell via the type IV secretion system, mediated by a type IV coupling protein (T4CP, also referred to as a "gatekeeper"). Within the recipient cell, the plasmid is then re-circularized. During infection, the initial steps are analogous, but instead of transferring the entire plasmid, only a small segment — the so-called T-DNA — is transferred to a neighbouring plant cell. This T-DNA is transported into the host cell nucleus, where it is integrated into the plant genome.
Since both mechanisms are influenced by phytochromes, yet previous microarray analyses failed to detect any regulation at the genetic level of the components involved, the hypothesis of a regulatory mechanism via protein–protein interactions moved into focus. This study therefore addresses the question of whether such interactions can be detected in vitro. For this purpose, all relevant relaxases of Agrobacterium fabrum C58 — TraATi, TraAAt, TraALC, and VirD2 — were purified, biochemically characterized, and tested for interactions with the phytochromes Agp1 and Agp2.
It was shown that all TraA relaxases recognize the same nick site on the Ti plasmid, perform the nicking reaction, and covalently bind to it — even though only TraATi is actually localized on this plasmid. In addition, an effect of phytochromes on the activity of the TraATi-mob fragment was observed. Further interaction experiments strongly indicated that a protein–protein interaction between Agp1 and TraATi is highly likely. Supporting evidence was also found for an interaction between Agp2 and TraATi, although it was less pronounced. In contrast, interactions with VirD2 yielded only weak or inconclusive signals. Taken together, the findings of this work support the hypothesis that protein–protein interactions may serve as a potential regulatory mechanism for horizontal gene transfer processes — particularly for bacterial conjugation.
