Strategien zur metabolischen Markierung von RNA lebender Zellen mittels IEDDA-Reaktion

Seit der Einführung der bioorthogonalen Reaktionen durch Bertozzi et al. in den frühen 2000er Jahren, hat sich die bioorthogonale Markierung zu einem leistungsfähigen und vielseitigen Werkzeug für die selektive Markierung von Biomolekülen in ihrer nativen zellulären Umgebung entwickelt. Für die Untersuchung der RNA Synthese und -Dynamik in Zellen sind effiziente Markierungsstrategien erforderlich, die nicht nur mit der zellulären Umgebung kompatibel sind, sondern auch in lebenden Zellen angewendet werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher Strategien entwickelt, die den metabolischen Einbau von Nukleosid- bzw. Nukleotid-Analoga mit hoch reaktiven chemischen Reportergruppen in neu synthetisierte zelluläre RNA ermöglichen. Eine Detektion der markierten RNA mit einem fluorogenen Tetrazin Fluorophor Konjugat mittels IEDDA Reaktion ermöglicht eine waschfreie, kontrastreiche Echtzeit Visualisierung von RNA in lebenden Zellen. Neben dem Einsatz eines 1 MCP modifizierten Nukleosids wurden insbesondere modifizierte Nukleosidtriphosphate (NTP) synthetisiert und charakterisiert, mit dem Ziel, die Limitierungen durch die Substratspezifität endogener Kinasen zu umgehen. ... mehrDie intrazelluläre Aufnahme der anionischen NTP erfolgte über den SNT Transporter oder durch die Anwendung des TriPPPro Konzepts. Zudem wurden anorganisch organische Hybridnanopartikel (IOH NP) synthetisiert und umfassend charakterisiert, um deren Potenzial als zelluläre Nukleotid-Transporter zu untersuchen.