Abstract:
Replikationskompetente behüllte Viren sind vielversprechend für den Einsatz in der onkolytischen Virotherapie und als Vektor für Krebsimpfstoffe. Sie verfügen den Wirtszellen-Spezifität und bieten in ihrem Genom Platz für therapeutisches Genmaterial. Ihre Lipidhülle und ihre Größe machen diese Viruspartikel (VP) jedoch empfindlich gegenüber Umweltfaktoren wie pH-Wert, Temperatur und Scherkräften. Dies macht milde und optimierte Bioprozesse erforderlich, um die Partikelintegrität und dadurch die Infektiosität während der Herstellung zu bewahren. Hohe Konzentrationen infektiöser und replikationskompetenter Partikel sind erforderlich, um die gewünschte therapeutische Wirkung auf Tumorzellen zu erzielen. ... mehrObwohl neue analytische und präparative Methoden, angepasst für die Anwendung von VP etabliert wurden, gibt es immer noch Wissenslücken und Herausforderungen. Das Wissen über die Bioprozesse wird durch iterative Experimente gesammelt, wodurch Prozesserfahrung aufgebaut wird. Bei VP ist die Übertragbarkeit zwischen Virusstämmen jedoch schwierig, so dass der Wissensgewinn in diesem neuen Bereich kleinteilig ist. Die Auswirkungen von Bioprozessschritten auf die Integrität verschiedener Virusstämme sind komplex und nicht gut verstanden. Außerdem wird die Prozessentwicklung durch den Mangel an schnellen und zuverlässigen Analysemethoden, die eine effiziente Charakterisierung der Prozessschritte ermöglichen, behindert. Dies verhindert technologischen Fortschritt, wie z. B. die mechanistische Modellierung, die eine zuverlässige, tiefgehende Charakterisierung der Prozessschritte erfordert. In dieser Dissertation wird der aktuelle Stand der präparativen Aufreinigungsmethoden für umhüllte VP zusammengefasst und anschlie- ßend Forschungsfortschritte für identifizierte Herausforderungen bei der Partikelquantifizierung und chromatographischen Reinigung vorgestellt. Zunächst bietet ein umfassendes Literatur Review einen Einblick in die Reinigungsprozesse replikationskompetenter umhüllter VP und unterstreicht die Wichtigkeit der Erhaltung ihrer Integrität für sichere und effektive therapeutische Anwendungen. Umhüllte VP bieten Vorteile wie große Genkapazität und Wirtszellen-Spezifität, sind jedoch empfindlich gegenüber Umweltfaktoren was erhebliche Herausforderungen im Bioprozess mit sich bringt. Die Heterogenität der Partikel erschwert die Entwicklung eines universellen Plattformprozesses und erfordert häufig eine de novo Prozessentwicklung für unterschiedliche Virusstämme. In diesem Review werden Reinigunsverfahren hinsichtlich ihres Einflusses auf die Partikelintegrität bewertet, angefangen bei der Zellernte über Zentrifugationsund chromatographische Techniken bis hin zur sterilen Filtration und Lagerung. Ein Schwerpunkt liegt auf Chromatographieschritten, in dem herkömmliche und neu angepasste stationäre Phasen verglichen werden. Konvektiv betriebene Phasen wie Membranadsorber und Monolithen sind für große VP vorteilhaft, da sie keine diffusionalen Einschränkungen aufweisen. Ihr hoher Stoffübergang und niedriger Rückdruck ermöglichen hohe Flussraten ohne Reduktion der Bindungskapazität. Vorund Nachteile sowie bestehende Wissenslücken in der VP-Reinigung werden beschrieben, ebenso wie analytische Lücken, die eine effiziente Bewertung der Partikelqualität und -quantität, und damit die Optimierung der Bioprozessschritte behindern. Die Dissertation geht in Forschungsartikel über, die Fortschritte bei analytischen und präparativen Methoden darstellen. Dabei kam ein modifiziertes Vesicular Stomatitis Virus (VSV) zum Einsatz. VSV ist ein patronen- (engl. “bullet-”) förmiges, umhülltes VP mit Abmessungen von ∼70 nm×∼200 nm. Die entwickelte analytische Methode adressiert den Bedarf an schneller und präziser VP-Quantifizierung, um Massenbilanzen zur Evaluierung von Prozessschritten zu ermöglichen. Vorgestellt wird eine markierungsfreie Methode, basierend auf Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. “high performance liquid chromatography”, HPLC) und Größenausschlusschromatografie (engl. “size exclusion chromatography”, SEC), gekoppelt mit UV-Detektion für die Partikelquantifizierung. Das Setup ist ergänzt durch einen Mehrwinkel-Lichtstreuungsdetektor (engl. “multi-angle light scattering”, MALS) zur Partikelcharakterisierung welcher zusätzliche Informationen wie Partikelgröße liefert. Die Methode wurde hinsichtlich einer hohen Rückgewinnungsrate der VP von der SEC Säule und dem HPLC System optimiert, um somit Robustheit und Zuverlässigkeit zu garantieren. Der SEC Auschlusspeak wurde mittels offline Analysen und online UV-Detektion als Viruspeak identifiziert, was sich in einem konsistenten UV 260 nm/UV 280 nm-Verhältnis zeigte. Die Methode zeigte hohe Präzision und Robustheit mit einer Reproduzierbarkeitsabweichung von unter 1 % und einer Prä- zisionsabweichung von unter 3 %. Der lineare Quantifizierungsbereich erstreckt sich von 7.1 × 108 bis 1.7 × 1011 VPs mL , mit einem Detektionslimit (engl. “limit of detection”, LOD) von 7.7 × 107 VPs mL und einer unteren Bestimmungsgrenze (engl. “lower limit of quantification”, LLOQ) von 4.2 × 108 VPs mL . Die Quantifizierung erwies sich als unabhängig von der unterschiedlichen Zusammensetzung der Probenmatrix durch die Reinigungsstufen. Während die Methode die Gesamtzahl der VP quantifiziert und eine orthogonal quantifiziertes Referenzmaterial benötigt, liefert sie Ergebnisse am selben Tag mit minimalem Arbeitsaufwand und ermöglicht schnelle Entscheidungen in VP-Reinigungsprozessen. Eine Anwendung für eine Massenbilanz des Chromatographieschrittes eines modifizierten VSV belegte ihre Eignung für Prozesscharakterisierungen und Entwicklung mechanistischer Prozessmodelle. Die anschließende Studie untersuchte spezifisch das Verhalten des modifizierten VSV in einem chromatographischen Reinigungsschritt. Bei der Charakterisierung des Capture-Schrittes mittels einem Kationaustauschchromatografen (engl. “cation exchange chromatography”, CEX) bei Verwendung eines Monolithen wurde ein unerwartetes fluiddynamisches Phänomen festgestellt. Es resultierte in einem Tailing-Effekt und der Trennung von Subpopulationen, welche sich nicht durch gängige chromatographische Prinzipien erklären ließen. Das Phänomen wurde als konvektiver Einschluss (engl. “convective entrapment”, CE) identifiziert, ein Effekt, bei dem große Biomoleküle vorübergehend in Engstellen der stationären Phase eingeschlossen werden. Partikel werden durch Advektion in diese Engstellen gedrückt und können nur durch Diffusion zurück in den Hauptströmungspfad gelangen. Frühere Studien zeigten diesen Effekt bei großen Biomolekülen mit der Auswirkungen von Ertragsverlusten und Verzögerungen in der Elution. Jedoch wurde dieser Effekt in konventionellen mechanistischen Chromatographiemodellen bisher nicht berücksichtigt. Im vorgestellten mechanistischen Modell wird der CE-Effekt mithilfe der Langmuir-Isotherme abgebildet und damit als eigenes Bindungsmodalität, zusätzlich zur elektrostatischen Wechselwirkung nach dem sterisches Massenwirkungsmodell (engl. “steric mass action”, SMA), beschrieben. Simulationen zeigten, dass hauptsächlich eine Subpopulation für das Tailing verantwortlich ist und eine stärkere Retention dem CE zuzuschreiben ist. Das Modell ermöglichte ein besseres Verständnis des präparativen Virusreinigungsprozesses, ist jedoch ohne weitere Entwicklung in seiner Anwendung eingeschränkt. Tailing durch den CE-Effekt ist bei charakteristischen Flussraten in allen Maßstäben zu erwarten, weshalb Ertragsverluste evaluiert und potenzielle Anpassungen der cleaning in place (CIP)-Protokolle geprüft werden sollten. Niedrige Flussraten oder Flusspausen können die Freisetzung der Partikel begünstigen. Zusammenfassend wurde der aktuelle Stand der Reinigungsmethoden für umhüllte VP evaluiert und Fortschritte in der VP-Prozessentwicklung vorgestellt. Das Literatur Review schafft eine Grundlage über den aktuellen Wissensstand und die Herausforderungen von VP-Bioprozessen, insbesondere hinsichtlich der Auswirkungen auf die virale Integrität. Es werden analytische Lücken identifiziert, welche schnelle Prozessentwicklungsiterationen verhindern. Eine dieser Lücken wird durch die Entwicklung einer Quantifizierungsmethode geschlossen, die schnelle und zuverlässige Ergebnisse liefert und die Charakterisierung von Prozessen ermöglicht. Die eingehende Charakterisierung eines präparativen Monolith-Chromatographieschrittes zeigte einen Mangel an Prozessverständnis, der sich in einem nicht erwarteten Tailing-Effekt manifestierte. Das strömungsdynamische Phänomen des convective entrapment wurde zum ersten Mal mit einem mechanistischen Modell dargestellt, das die Bewertung seiner Auswirkungen durch Simulationen ermöglicht. Weitere Studien könnten das mechanistische Modell verbessern, um in silico Optimierungen und eine robuste Herstellung von umhüllten VP zu ermöglichen.
Abstract (englisch):
Replication-competent enveloped viruses show promise for use in oncolytic virotherapy and as vector for cancer vaccines. They confer host cell target specificity, and provide large capacity in their genome to carry therapeutic cargos. However, their lipid envelope and size renders these virus particles (VPs) sensitive against environmental factors such as pH, temperature and shear forces. This necessitates mild and optimized bioprocesses to maintain particle integrity and preserve infectivity during manufacturing. High concentrations of infectious and replication-competent particles are needed to achieve the desired therapeutic effect on tumor cells. ... mehrAlthough new analytical and preparative methods have been tailored and established for VP applications, gaps and challenges prevail. Bioprocessing knowledge accumulates through iterative experiments, generating process experience. However, for VPs the transferability between virus strains is difficult and thus knowledge gain in this new field is cumbersome. E.g., the effects of bioprocessing steps on the integrity of various virus strains are complex and not well understood. Also, process development is constricted due to the lack of fast and reliable analytical methods capable of efficient evaluation of process steps. This hinders technological progress such as mechanistic modeling which requires reliable in-depth characterization of process steps. This doctoral thesis synthesizes the current state of preparative processing methods for enveloped VPs and subsequently presents research advancements for identified challenges in particle quantification and chromatographic purification. First, a comprehensive literature review examines the purification processes for replication-competent enveloped VPs, emphasizing the importance of maintaining their integrity for safe and effective therapeutic applications. Enveloped VPs offer substantial advantages, including large gene insert capacities and target specificity, however their inherent sensitivity to environmental factors presents significant bioprocessing challenges which needs to be considered. Further, particle heterogeneity hinders the development of a broadly applicable platform process, often necessitating de novo process development for different virus strains. In this review purification process technologies are evaluated for their influence on particle integrity, including cell-culture harvest, centrifugation and chromatographic techniques, sterile filtration and storage considerations. A focus is set on chromatography steps in which conventional and new, tailored stationary phases are compared. Convective-driven stationary phases like membrane adsorbers and monoliths are beneficial for large VPs due to the lack of diffusional limitations. A key benefit is their ability to facilitate high mass transfer rates and low back pressure, enabling high flow rates without compromising binding capacity. The review describes individual process steps and identifies knowledge gaps and challenges in VP purification. One of them being an analytical gap which hinder the efficient characterization of VP process steps due to lack of efficient and robust analytical methods. Slow and low throughput methods are typically used which slow down process development. The thesis progresses into research articles which constitute advancements in analytical and preparative methods. A modified vesicular stomatitis virus (VSV) was utilized in the studies. VSV is a bullet-shaped enveloped VP, of ∼70 nm × ∼200 nm in size. The analytical method developed in this thesis addresses the need for a rapid and precise VP quantification to facilitate mass balance calculations to evaluate and characterize process steps. A label-free high performance liquid chromatography (HPLC)-based method is presented utilizing size exclusion chromatography (SEC) coupled with UV for particle quantification. This setup integrates a multi-angle light scattering (MALS) detector for particle characterization, providing additional information such as particle size. The method was optimized to achieve high VP recovery from the SEC column and HPLC system to establish a robust and reliable method. The SEC exclusion peak was confirmed to be the virus peak through offline analytical methods and online UV detection, resulting in a consistent UV 260 nm to UV 280 nm ratio. The method demonstrated high precision and robustness, with repeatability variation of less than 1 % and intermediate precision deviation of less than 3 %. The linear quantification range spans 7.1 × 108 to 1.7 × 1011 VPs mL , with a limit of detection (LOD) of 7.7 × 107 VPs mL and lower limit of quantification (LLOQ) of 4.2 × 108 VPs mL . The quantification method proved to be independent by variations in process sample matrices from different purification processing steps. While the method quantifies total VPs and requires an orthogonally quantified reference material, it delivers same-day results with minimal hands-on time, enabling fast process evaluation and thus fast decisions in VP purification processes and development. It further facilitates in-depth process characterizations and mass balance calculations as shown for a cation exchange chromatography (CEX) step of the VSV purification. This enables the development of mechanistic process models for which process understanding and characterization is needed. In the next presented study, the chromatographic behavior of modified VSV particles on a CEX purification step is investigated and mechanistic model developed. During the characterization of the CEX monolith capture step, an unexpected fluid-dynamic phenomenon was observed. It resulted in a tailing effect and subpopulation separation that could not be explained by anticipated chromatographic behaviors. The phenomenon was identified as convective entrapment (CE), an effect where large biomolecules are temporarily restricted in the resin’s constriction sites. Particles are pushed into these narrow sites by advection and can only be released by diffusing back through the opening, relying on chance to take a different flow path. Previous research has demonstrated this effect for large biomolecules, impacting recovery and leading to peak delays or tailing, but it has not been accounted for in chromatographic mechanistic models. In the presented model the CE effect is implemented by the Langmuir isotherm. This approximation represents CE as a binding modality, additionally to electrostatic interaction modeled by a steric mass action model (SMA) isotherm. The simulations showed that a subpopulation was primarily responsible for the tailing, with a stronger retention attributed to the CE. The model supports knowledge gain for the preparative virus purification run, however it is limited in its application scope (e.g., a fixed flow rate is used) without further development. Tailing effects due to CE are expected across all scales at characteristic flow rates, necessitating evaluation of recovery losses and potential adjustments of cleaning in place (CIP) steps. Low flow rate steps or flow rate pauses can facilitate particle release. In summary, the current state of purification methods for enveloped VPs was assessed, and advancements in VP process development were discussed. The literature review establishes a baseline of current knowledge and challenges in bioprocessing, especially regarding the impact on viral integrity. Analytical gaps are identified which prevent fast process development iterations. This gap is addressed by the development of a quantification method which provides fast and reliable results and enables process characterizations. The in-depth characterization of a preparative monolith chromatography step revealed a lack of process understanding which was manifested in a tailing effect not anticipated. The fluid dynamic phenomenon of convective entrapment was represented for the first in a mechanistic model, enabling evaluation of its impact through simulations. Further studies could advance the mechanistic model to enable in silico optimizations and a robust manufacturing of enveloped VPs.
